常青

(遼寧省葫蘆島市園林管理處,遼寧 葫蘆島 125000)

1 引言

羽衣甘藍(Brassica oleracea var.acephala f.tricolor Hort.)是十字花科蕓薹屬甘藍種的一個變種,兩年生草本花卉,又名葉牡丹。其葉形美觀多變,心葉色彩豐富艷麗,耐寒性極強,是難得的秋冬季及早春室內(nèi)外綠化的好材料,現(xiàn)在各地廣為栽培[1]。

RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)技術(shù)是Williams[2]于1990年首先創(chuàng)立的一種DNA分子標(biāo)記技術(shù)。它利用隨機的10個堿基的寡核苷酸作為引物,對基因組DNA進行PCR擴增。這些擴增DNA產(chǎn)物片段的多態(tài)性反映了基因組相應(yīng)區(qū)域的DNA多態(tài)性[3]。

本實驗應(yīng)用RAPD技術(shù)從64個隨機引物中篩選出適宜的RAPD引物,對14種羽衣甘藍新品種基因組DNA進行多態(tài)性研究,以分析羽衣甘藍的親緣關(guān)系,為今后配置更加合理的雜交組合提供分子依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 供試材料

本試驗采用從國內(nèi)外收集的羽衣甘藍新品種14份,作為供試材料。

2.2 實驗方法

2.2.1 羽衣甘藍總DNA的提取及檢測

實驗采用改進CTAB法提取羽衣甘藍基因組DNA,將0.1g嫩葉在液氮中迅速研碎,取0.05g粉末迅速移入1.5mL離心管中,立即加入65℃預(yù)熱的CTAB提取緩沖液500μ L,65℃水浴30min,期間顛倒幾次;加入等體積氯仿/異戊醇(24∶1)抽提2次。取上清液,加無水乙醇,-20℃放置 1h。10000r/min離心;棄上清,加入 TE溶解,顛倒混勻,然后再10000r/min離心;將上清液轉(zhuǎn)入新1.5mL 離心管中 ,加入 RNase(10μ g/μ L),輕輕混勻后在37℃水浴1h;取出靜置,冷卻至室溫后,加入1/10體積NaAc(pH5.2)和2倍體積無水乙醇,顛倒混勻后-20℃放置 1h。10000r/min離心;棄上清,用70%乙醇洗滌沉淀2次,放置超凈工作臺上吹干;加入 50μ LT E溶解;置于 4℃?zhèn)溆没?-20℃儲藏。

提取的羽衣甘藍基因組DNA通過凝膠電泳檢測,加樣于0.8%(m/v)瓊脂糖凝膠(含核酸染料,0.5μ g/mL),在 LKB型電泳儀中電泳,并以 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)作對照,估測 DNA分子量。紫外燈365nm波長下觀察、照相。

2.2.2 RAPD擴增

反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性5min;94℃變性30s,37℃退火30s,72℃延伸1min,40個循環(huán);最后72℃延伸7min。原始20μ L反應(yīng)體系:2μ LlO×PCR反應(yīng)緩沖液;1.5mmol/LMgCl2;0.2mmol/LdNTP;0.3μ mol/L 引物;稀釋 10 倍的總 DNA5μ L;1UTaq酶;滅菌的超純水補齊體積到20μ L。以上藥品均購自TIANGEN生物制劑(北京)有限公司,引物由寶生物工程(大連)有限公司合成,擴增反應(yīng)在Whatman Biometra GmbH(Germany)公司生產(chǎn)的 TGradient Thermobolck擴增儀中進行。

社交媒體營銷所針對的目標(biāo)市場。在使用社交媒體所針對目標(biāo)市場的問題上，11家酒店既表現(xiàn)出了相似性，又表現(xiàn)出了差異性。6家酒店表示他們的社交媒體平臺既關(guān)注已經(jīng)購買過酒店產(chǎn)品的消費者，也關(guān)注潛在的未來消費者。另外5家酒店主要關(guān)注新客戶和潛在的未來客戶。雖然有3家酒店表示他們不會通過社交媒體平臺去關(guān)注特定的消費群體，但其余的8家酒店或多或少地會只關(guān)注他們認為符合自己酒店品牌特色的消費群體。

2.2.3 擴增產(chǎn)物分析

擴增產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠上電泳,在紫外燈(TCP-15-M型)下觀察并照相。將RAPD圖譜上清晰穩(wěn)定出現(xiàn)的條帶記為“1”,同一位置沒有條帶記為“0”,將條帶信息轉(zhuǎn)換成由“0”和“1”組成的原始矩陣。應(yīng)用DPS(version3.01)軟件計算各材料間歐氏遺傳距離,采用類平均距離法(UPGMA)構(gòu)建聚類圖,分析各品種之間的親緣關(guān)系。

3 實驗結(jié)果分析

3.1 提取基因組DNA質(zhì)量檢測

通過瓊脂糖凝膠電泳,可以得出所提取的樣品DNA在20kb左右,沒有出現(xiàn)斷裂和降解,因此,可用于PAPD的PCR擴增。進一步用紫外分光光度法測得OD260/OD280值均在1.8～2.0之間,表明用改良CTAB法所提取的DNA質(zhì)量較高,可以滿足下游的PAPD反應(yīng)對模版純度的要求。

3.2 RAPD體系優(yōu)化

在原始RAPD反應(yīng)體系基礎(chǔ)之上,采用單因素法調(diào)整反應(yīng)體系各組分的濃度,摸索建立更加適合羽衣甘藍的RAPD反應(yīng)體系。

3.2.1 模板濃度的影響

為確定適宜的RAPD分析的DNA濃度,試驗設(shè)置6種DNA濃度梯度,依次為稀釋1倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍。結(jié)果表明:模板濃度在稀釋1倍和10倍時,擴增條帶清晰,在稀釋20倍以后開始模糊,稀釋100倍和200倍時非特異擴增明顯增加。所以本試驗選取稀釋 10倍的模板作為RAPD反應(yīng)的濃度。

3.2.2 MgCl2濃度對RAPD擴增效果的影響

3.2.3 dNTP濃度對擴增的影響

dNTP濃度也是影響RAPD擴增的重要因素,試驗dNTP濃度設(shè)置為 0.05mmol/L、0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L。由圖 4可以看出 dNTP濃度為0.05mmol/L、0.1mmol/L時無明顯擴增條帶,濃度為0.4mmol/L時條帶清晰,擴增帶數(shù)、帶型和帶的明暗程度都處于較理想狀態(tài),試驗選取0.4mmol/L作為正式擴增條件。

3.2.4 TaqDNA聚合酶用量對RAPD的影響

試驗設(shè)置了6個 TaqDNA梯度,0.5U、1.0U、1.5U、2.0U、2.5U、3.0U。試驗結(jié)果表明:Taq酶具有很高的活性,在低濃度下也有擴增效果,但擴增量少。在1.5U時,條帶清晰且亮度明顯增強。隨著用量增加條帶亮度稍有增加,但逐漸有非特異擴增出現(xiàn)。所以確定Taq聚合酶濃度為1.5U。

3.2.5 引物濃度對RAPD擴增的影響

試驗同時對引物濃度進行了優(yōu)化,引物梯度設(shè)置 為:0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L、1.2mmol/L。依據(jù)試驗結(jié)果確定較適合的引物濃度為0.4mmol/L。最終確立適合羽衣甘藍基因組的RAPD擴增反應(yīng)體系為:2μ LlO×PCR反應(yīng)緩沖液;2.0mmol/LMgCl2;0.4mmol/LdNT P;0.4μ mol/L 引物;稀釋 10 倍的總DNA5μ L;1.5UTaq酶;滅菌的超純水補齊體積到 20μ L。

3.3 引物的篩選

用優(yōu)化后的反應(yīng)體系,選取一個品系DNA對64個引物進行篩選。每個引物都有擴增產(chǎn)物,從中篩選出10條擴增譜帶清晰、穩(wěn)定且多態(tài)性好的引物用于聚類分析。

利用獲得的RAPD標(biāo)記,用UPGMA法建立了14份羽衣甘藍新品種之間的遺傳關(guān)系聚類分析圖。在歐氏遺傳距離為4.7處,14個品種分成4類。第1類4個品種,均為圓葉;第 2類 4個品種,為羽葉和圓葉;第3類5個品種,均為皺葉品種;第 4類為品種14,田間性狀為皺葉白心。其中遺傳距離最近的為3和4,歐氏距離值為2.449,這2個品系農(nóng)藝性狀都表現(xiàn)為皺葉粉心;聚類圖中品系 2、3、4、5首先聚在一起,其農(nóng)藝性狀較近似,田間試驗結(jié)果驗證了這些材料的同源性很高,與聚類結(jié)果相一致;而品種14雖表現(xiàn)為皺葉,但其葉色和株型與其它皺葉品種有較大差異,所以與其它皺葉品種親緣關(guān)系較遠。

4 結(jié)語

從試驗結(jié)果看,改良CTAB法提取得到的DNA其純度和濃度均達到了RAPD反應(yīng)對模板的要求。提取過程中有效去除較多的蛋白質(zhì)和多糖類物質(zhì)是保證高質(zhì)量DNA的關(guān)鍵,針對羽衣甘藍中糖及蛋白含量高的特點,本方法中用氯仿/異戊醇抽提兩次,可有效地解決這一問題。

RAPD是利用寡聚核苷酸對基因組DNA進行多態(tài)性分析,檢測區(qū)域幾乎覆蓋了整個基因組,因而可以檢測不同品種間微小差異。從試驗結(jié)果看,供試材料間存在較明顯的差異,即使一些性狀表現(xiàn)相近的品種間也存在多態(tài)性。因此,RAPD技術(shù)用于羽衣甘藍品種間親緣關(guān)系分析是可行的。

在RAPD聚類分析中,將羽葉品系和圓葉品系分別聚為一類,表現(xiàn)了田間試驗與本試驗的一致性。同時也看到聚類圖中將羽葉品系13和圓葉9品系首先聚到一起后又和羽葉品系6在歐氏距離3.95處聚到一起,說明羽葉品系13和圓葉品系有較近親緣關(guān)系。也可能說明 RAPD可以檢測出葉型差異所造成的遺傳差異,另一方面也說明可能篩選引物的數(shù)量還不足以完全檢測出各品系間的差異。

[1]饒璐璐.羽衣甘藍(kale)[J].蔬菜,1997(1):11～12.

[2]王關(guān)林,方宏筠.植物基因工程原理與技術(shù)[M].北京:科學(xué)出版社,1998.

[3]孫彩霞,張明永.中國蘭屬植物種間及品種間親緣關(guān)系的RAPD分析[J].園藝學(xué)報,2005,32(6):1121～1124.