朱 博，李 強(qiáng)

（江蘇科技大學(xué)，江蘇 鎮(zhèn)江212018）

1 引言

人類對(duì)微生物的利用經(jīng)歷了天然混合培養(yǎng)到純種培養(yǎng)2個(gè)階段。過(guò)去的多數(shù)發(fā)酵食品都來(lái)源于混合發(fā)酵，由于多菌發(fā)酵是一個(gè)完整的或接近完整的生物體系，體系中的微生物之間大多數(shù)具有生長(zhǎng)代謝協(xié)調(diào)作用。自從純種分離技術(shù)被廣泛應(yīng)用以來(lái)，人們研究的重點(diǎn)、焦點(diǎn)似乎都在單一的菌種上，忽略了天然發(fā)酵的模式，那就是生存環(huán)境的完整性和協(xié)調(diào)性。利用混合菌種發(fā)酵生產(chǎn)飲料正是利用幾千年以來(lái)各菌種之間的共生性。純培養(yǎng)技術(shù)使得研究者擺脫了多種微生物共存的復(fù)雜局面，能夠不受干擾地對(duì)單一目的菌株進(jìn)行研究，從而豐富了我們對(duì)微生物形態(tài)結(jié)構(gòu)，生理和遺傳特性的認(rèn)識(shí)。但是，在長(zhǎng)期的實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)實(shí)踐中，人們不斷地發(fā)現(xiàn)很多重要生化過(guò)程是單株微生物不能完成或只能微弱地進(jìn)行的，必須依靠?jī)煞N或多種微生物共同培養(yǎng)完成。微生物混合培養(yǎng)或混合發(fā)酵已越來(lái)越被人們所重視。

2 混合發(fā)酵生產(chǎn)功能性飲料

目前混合發(fā)酵在功能性飲料的開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)方面有廣泛的應(yīng)用。根據(jù)國(guó)際飲料行業(yè)協(xié)會(huì)的新規(guī)定，功能性飲料是指具有保健功能的軟飲料。目前市場(chǎng)上的功能性飲料主要分為3類，即運(yùn)動(dòng)飲料、能量飲料和其他飲料，其大多含有氨基酸、礦物質(zhì)，以及各種維生素等人體所需物質(zhì)。這些飲料的開(kāi)發(fā)多數(shù)采用了混合發(fā)酵技術(shù)，也有部分是采用直接從生物體提取和單菌發(fā)酵方法的。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和人民生活水平的不斷提高，飲料消費(fèi)迅速增加。據(jù)有關(guān)資料顯示，1980年我國(guó)飲料產(chǎn)量?jī)H28萬(wàn)t，1995年則猛增到1 000萬(wàn)t，2005年達(dá)到2 000萬(wàn)t，25年間平均以26.7%的速度增長(zhǎng)。如此巨大的飲料市場(chǎng)，發(fā)酵功能性飲料必須占有一席之地。據(jù)國(guó)家統(tǒng)計(jì)局、中國(guó)飲料工業(yè)協(xié)會(huì)、中國(guó)食品工業(yè)協(xié)會(huì)、中國(guó)海關(guān)、中國(guó)經(jīng)濟(jì)信息中心、中國(guó)競(jìng)爭(zhēng)情報(bào)網(wǎng)、中國(guó)食品商務(wù)網(wǎng)、全國(guó)及海外500多種相關(guān)報(bào)紙雜志的基礎(chǔ)信息等公布和提供的大量資料顯示，中國(guó)飲料市場(chǎng)成為中國(guó)食品行業(yè)中發(fā)展最快的市場(chǎng)之一。2003年中國(guó)飲料產(chǎn)量2373萬(wàn)t，比2002年增長(zhǎng)16.84%。實(shí)現(xiàn)工業(yè)總產(chǎn)值（當(dāng)年價(jià)）813.87億元，銷售收入774.42億元，分別比上年增長(zhǎng)40.12%和40.41%。以“紅?！薄懊}動(dòng)”等新一代品牌為代表的功能性飲料已被廣大消費(fèi)者所接受，并在健康潮中掀起一股功能性飲料的熱潮。就我國(guó)目前的飲料市場(chǎng)來(lái)看，功能性飲料正處于黃金發(fā)展時(shí)期，具有極大的開(kāi)發(fā)空間［1］。

3 微生物混合培養(yǎng)生產(chǎn)藥品

3.1 維生素的混合發(fā)酵生產(chǎn)

維生素C二步發(fā)酵是混合發(fā)酵的典型實(shí)例。這種方法是由中科學(xué)院微生物所和北京鑭藥廠合作，于20世紀(jì)70年代初發(fā)明的。其第2步發(fā)酵由氧化葡萄糖酸桿菌和巨大芽孢桿菌等伴生菌混合發(fā)酵完成，其中小菌為合成維生素C前體2-酮基-L-古龍酸（2KGA）的菌株，但很難單獨(dú)培養(yǎng)，且單獨(dú)培養(yǎng)產(chǎn)酸能力很低；大菌單獨(dú)培養(yǎng)容易，但不產(chǎn)生2-KGA，與小菌混合培養(yǎng)時(shí)不僅可促進(jìn)小菌生長(zhǎng)，而且能大大增強(qiáng)小菌的產(chǎn)酸能力［2］。能與小菌混合培養(yǎng)合成2-KGA的伴生大菌有很多，除巨大芽孢桿菌外，還有蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌地衣芽孢桿菌，蘇云金芽孢桿菌等，某些酵母亦有該作用。有關(guān)研究表明，大菌為小菌提供某種生長(zhǎng)因子促進(jìn)其生長(zhǎng)，并且提供某些生物活性物質(zhì)協(xié)助小茵合成2-KGA，二菌混合培養(yǎng)呈互生關(guān)系［3］。通過(guò)調(diào)節(jié)二菌比例、pH值、溫度及溶氧量等因素，可使混合菌達(dá)到較適的生態(tài)狀態(tài)，發(fā)揮較高的生產(chǎn)效能。二者間的關(guān)系和作用機(jī)制正在進(jìn)一步深入研究中。此外維生素B12可利用謝氏丙酸桿菌和馬鈴薯芽孢桿菌或大腸桿菌的混合培養(yǎng)生成。

3.2 抗菌肽的生產(chǎn)

乳酸菌素是一種由乳酸菌屬菌株產(chǎn)生的抗菌肽類，可抑制多種革藍(lán)氏陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)，已被50余個(gè)國(guó)家用作食品保鮮劑［3］。1999年Shimizu等［4］報(bào)道，以Lactococcus lactis和Kluyveromyces marxianus混合培養(yǎng)可有效地生成乳酸菌素，這主要是由于Kluyveromyces marxianus可通過(guò)消耗前者產(chǎn)生的乳酸控制發(fā)酵體系的pH值，從而使乳酸菌素的產(chǎn)率維持高水平。

3.3 甾體轉(zhuǎn)化

多種甾體類藥物的轉(zhuǎn)化也是利用混合菌培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)的。諾卡氏菌和節(jié)桿菌培養(yǎng)用于5α-Δ9（11）-16β-甲基-3β，17α，21-羥基-孕甾烯-3β，21-雙醋酸酯-20酮和5α，17α-甲基-17β羥基-雄甾-3酮的1，4位上的脫氫轉(zhuǎn)化［4］簡(jiǎn)單節(jié)桿菌和玫瑰產(chǎn)色桿菌的混合培養(yǎng)也可用于甾體轉(zhuǎn)化。

4 微生物混合培養(yǎng)用于生物降解

蛋白質(zhì)是配合飼料中的主要營(yíng)養(yǎng)成分，一般占20%左右。隨著畜牧業(yè)的迅猛發(fā)展，對(duì)飼料蛋白的需求量日益增加。因此尋求新的飼料蛋白來(lái)源便顯得十分重要。我國(guó)薯類作物產(chǎn)量很高，但因其本身蛋白含量很低，直接用作飼料其生物效價(jià)不高通過(guò)微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)可由豐富的薯類資源得到菌體菌蛋白飼料，從而可在一定程度上緩解日益突出的飼料蛋白短缺問(wèn)題。對(duì)淀粉質(zhì)原料而言，通常采用的工藝是原料先經(jīng)酸法或酶法糖化等預(yù)處理，將淀粉降解為可發(fā)酵性糖，然后再接種相應(yīng)的高蛋白產(chǎn)生菌合成微生物菌體蛋白。為簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝，直接采用具有淀粉分解能力的菌種發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料已日益受到重視。

我國(guó)是蛋白質(zhì)飼料資源短缺的國(guó)家，目前蛋白質(zhì)飼料年缺口約為1 500萬(wàn)t。據(jù)預(yù)測(cè)2010年到2020年我國(guó)蛋白質(zhì)飼料資源需求分別為6 000萬(wàn)t和7 200萬(wàn)t［5］。目前我國(guó)發(fā)酵工業(yè)的廢菌渣和糟渣類農(nóng)副產(chǎn)品下腳料以及廢棄物大多沒(méi)有充分利用，這不僅造成資源浪費(fèi)，而且造成環(huán)境污染［6～13］?，F(xiàn)在生產(chǎn)主要是以食用菌生產(chǎn)過(guò)程中的廢菌渣為主要基質(zhì)，篩選適合分解利用廢菌渣的多種大型食用真菌和酵母菌，采用單獨(dú)培養(yǎng)和混菌共同發(fā)酵工藝來(lái)生產(chǎn)飼料蛋白，以實(shí)現(xiàn)廢棄物質(zhì)資源化和物資的循環(huán)再生，減少環(huán)境污染。

4.1 對(duì)原油的降解

生物修復(fù)是治理土壤石油污染的重要方法，主要原理是微生物利用石油作為碳源進(jìn)行同化降解，使其轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)害的無(wú)機(jī)物質(zhì)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，單菌株所能代謝的石油組分有限，大多數(shù)石油降解菌株只能代謝一種或幾種石油烴。但經(jīng)過(guò)混合菌對(duì)原油的降解及其降解性能的研究，發(fā)現(xiàn)經(jīng)馴化后的烷烴降解菌GS3C、菲降解菌GY2B、芘降解菌GP3A和GP3B對(duì)原油都具有一定的降解效果。GS3C能基本去除原油中的直鏈烷烴化合物，GP3A對(duì)C＜25的中短鏈烷烴化合物有較好的降解效果。構(gòu)建的混合菌組G1、G3、G8、G11的降解效果較單一菌株有明顯的提高，去除率都達(dá)到了50%以上，能基本去除原油中的直鏈烷烴類化合物［14］。

4.2 對(duì)生活垃圾的降解

世界每年產(chǎn)生大量生活垃圾，處理方法主要是堆埋和焚燒，占用土地和浪費(fèi)能源，既污染環(huán)境又帶來(lái)一定危害。生活垃圾在經(jīng)過(guò)發(fā)酵后可作為有機(jī)肥料，但在一般條件下，其發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)且肥效低，影響了其實(shí)際應(yīng)用［15］。

有研究表明纖維素分解菌可混合培養(yǎng)，自生固氮菌利用纖維素分解菌分解纖維產(chǎn)生的葡萄糖作為碳源，纖維素分解菌利用固氮菌固定的氮作為氮源，兩者相互利用、相互依存，進(jìn)行生長(zhǎng)和繁殖。兩者混合培養(yǎng)的菌數(shù)和發(fā)酵液總含氮量明顯高于各自單獨(dú)培養(yǎng)。自生固氮菌與纖維素分解菌的混合菌液作用于生活垃圾，可大大提高生活垃圾的降解速度，同時(shí)其降解物的含氮量也有明顯的提高。用這種方法處理生活垃圾既可以提高生活垃圾的降解速度又使其含氮量增加，提高了肥力，同時(shí)其降解物中含有大量的有生物活性的固氮菌及纖維素分解菌，所以是一種優(yōu)良的生物活性肥料。將其施用于土壤中，既增加土壤的肥力，又增加土壤中固氮菌及纖維素分解菌的數(shù)量，有利于土壤中有機(jī)質(zhì)的分解及土壤自生固氮，進(jìn)一步增加土壤肥力，改良土壤，減少化肥的施用，有利于環(huán)境保護(hù)［16］。

4.3 氨基多糖生物降解氨基多糖

氨基多糖主要以幾丁質(zhì)和脫乙酰幾丁質(zhì)的形式存在于節(jié)肢動(dòng)物外骨骼和真菌細(xì)胞壁中，在自然界中的含量?jī)H次于纖維素。利用微生物對(duì)氨基多糖進(jìn)行降解和轉(zhuǎn)化，有可能生成具有生物功能的活性糖蛋白。王士奎以Beauveria Bassiana LB90為氨基多糖降解菌，以Candida sp.LB50作為氨基糖轉(zhuǎn)化菌，建立了氨基多糖混合菌生物降解和轉(zhuǎn)化模型。與純培養(yǎng)比較，粘度下降比率提高23.0%，可溶性糖含量增加167.7g／mL，兩菌呈互生關(guān)系［17］。

5 混合發(fā)酵開(kāi)發(fā)清潔新能源

5.1 沼氣發(fā)酵中的作用

沼氣發(fā)酵是由多種產(chǎn)甲烷菌和非產(chǎn)甲烷菌混合共同發(fā)酵完成的。我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，每年產(chǎn)農(nóng)作物秸稈7億t以上，禽畜糞便大約1.4億t。隨著農(nóng)村經(jīng)濟(jì)發(fā)展和農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整，牲畜養(yǎng)殖已經(jīng)由過(guò)去的農(nóng)戶分散養(yǎng)殖過(guò)渡為集中養(yǎng)殖，并且大多集中在大城市附近，這必將造成農(nóng)村戶用沼氣池發(fā)酵原料的短缺。因此，尋求新的發(fā)酵原料將是亟待解決的問(wèn)題。然而單一以秸稈作為發(fā)酵原料，由于其碳氮比高、速效養(yǎng)分含量低、纖維木質(zhì)素含量高，表面有一層蠟質(zhì)，不利于微生物的附著，且降解率低、厭氧消化時(shí)間長(zhǎng)、易出現(xiàn)漂浮分層，一直不能被廣大農(nóng)民所接受。將糞便和秸稈混合發(fā)酵，可以有效彌補(bǔ)秸稈作為發(fā)酵原料的弊端［18～19］。

5.2 乙醇發(fā)酵

作為可更新可持續(xù)的生物能源，生物酒精是經(jīng)濟(jì)高速發(fā)展過(guò)程中替代傳統(tǒng)石油燃料能源的最佳選擇之一。把纖維素作為可更新資源通過(guò)微生物降解轉(zhuǎn)化生成糖類，然后糖類進(jìn)一步發(fā)酵轉(zhuǎn)化成液體燃料具有廣闊的應(yīng)用前景［20～23］。然而，纖維素酒精的規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)還面臨很多嚴(yán)峻的實(shí)際問(wèn)題，其主要問(wèn)題之一就是微生物對(duì)纖維素的降解效率以及糖類發(fā)酵轉(zhuǎn)化成酒精的效率太低［20，21］。研究表明，熱纖維梭菌（Clostridiumthermocellum）是一種高效的纖維素降解細(xì)菌，但其酒精生產(chǎn)效率較低［22，23］；嗜熱厭氧乙醇菌（Thermoanaerobacterethanolicus）不能降解纖維素，但其能夠有效的發(fā)酵糖類而轉(zhuǎn)化為酒精。因此對(duì)兩者進(jìn)行混合培養(yǎng)，可以利用熱纖維梭菌高效降解纖維素轉(zhuǎn)化成糖類，然后糖類可以作為嗜熱厭氧乙醇菌的底物通過(guò)發(fā)酵轉(zhuǎn)化成酒精，這樣一個(gè)穩(wěn)定的混合培養(yǎng)體系可以作為纖維素酒精工業(yè)化生產(chǎn)微生物群落較好的選擇。本研究主要以熱纖維梭菌和嗜熱厭氧乙醇菌為對(duì)象，以Solka Floc為底物纖維素，系統(tǒng)分析了熱纖維梭菌純培養(yǎng)以及熱纖維梭菌和嗜熱厭氧乙醇菌混合培養(yǎng)對(duì)纖維素酒精生產(chǎn)能力、纖維素降解能力及終產(chǎn)物分布的影響，以期為纖維素酒精工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

6 結(jié)語(yǔ)

雖然微生物混合發(fā)酵技術(shù)的部分成果已成功應(yīng)用于部分工業(yè)生產(chǎn)，但在大多數(shù)混合菌體系中，菌間相互作用機(jī)制和發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)于各種混合菌之間的影響的研究還很少。同時(shí)對(duì)于菌株混合時(shí)的安全性還沒(méi)有系統(tǒng)的評(píng)估和研究?；旌习l(fā)酵關(guān)鍵是摸索pH、溫度、混合比例、菌株混合時(shí)間等多菌種的共同培養(yǎng)條件，從而確定菌株發(fā)揮最大協(xié)同作用的結(jié)合點(diǎn)。為了使混合發(fā)酵能夠更好地應(yīng)用于工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)，使其最終具有良好的大規(guī)模生產(chǎn)的工業(yè)應(yīng)用前景。針對(duì)目前混合發(fā)酵的隨機(jī)組合和盲目的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，需要深入研究并且建立快速有效的混合菌發(fā)酵模型是非常必要的。因此，如果從生理、代謝和遺傳角度對(duì)混合菌間關(guān)系和協(xié)同作用機(jī)制進(jìn)行深入研究，對(duì)混合菌培養(yǎng)的理論和應(yīng)用都將有巨大的突破。所以未來(lái)的研究重點(diǎn)可能集中在多菌組合模式、篩選適合菌株，并且優(yōu)化混合培養(yǎng)的條件?；旌习l(fā)酵有廣闊的發(fā)展空間，在工業(yè)發(fā)酵中如果得以合理的運(yùn)用，就必定可以提高生產(chǎn)效率與產(chǎn)品質(zhì)量，為實(shí)現(xiàn)綠色無(wú)污染生產(chǎn)提供了新的發(fā)酵模式。

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