吳連春，張秀玲

1.河北聯(lián)合大學(xué)，河北 唐山 063020 2.河北聯(lián)化學(xué)工程學(xué)院，河北 唐山 063009

溶菌酶，全稱為1，4-β-N-溶菌酶，又稱胞壁質(zhì)酶或粘肽N-乙?；邗Ｋ饷?是一種對(duì)微生物的細(xì)胞壁特別是致病細(xì)菌中的黏多糖具有專門作用的水解酶，通過切斷N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之間的β-1，4糖苷鍵聯(lián)結(jié)，解體肽聚糖支架，從而在內(nèi)部滲透壓的作用下使細(xì)胞脹裂，細(xì)菌裂解。溶菌酶還可與帶負(fù)電的病毒蛋白結(jié)合，與DNA、RNA、脫輔基蛋白形成復(fù)鹽，使病毒喪失活性。因此溶菌酶具有抗菌、消炎、殺毒等作用[1-2]。

由于溶菌酶能夠選擇性地分解微生物的細(xì)胞壁，并且自身沒有毒害，因此作為一種天然、安全的殺菌劑和防腐劑，在食品工業(yè)、醫(yī)藥制劑、日用化工等行業(yè)被普遍重視。隨著開發(fā)和應(yīng)用研究的進(jìn)一步深入，溶菌酶的發(fā)展前景將會(huì)十分廣闊。

1 溶菌酶的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)

溶菌酶是一種葡萄糖苷酶，其中雞蛋清溶菌酶是目前研究最清楚的一種溶菌酶，它是由18種129個(gè)氨基酸殘基2200個(gè)原子組成的單肽鏈蛋白質(zhì)，分子量14388～18000[3]。

純品溶菌酶為粉末狀白色結(jié)晶，無嗅、味甜，易溶于水、乙醇，不溶于丙酮、乙醚等[4]；在酸性溶液中其化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性均較強(qiáng)，在pH=3，100oC條件下加熱處理45min仍保持活性 ；在堿性條件下化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，易被破壞，熱穩(wěn)定性也很差[5]。

2 溶菌酶的分離純化方法

由于溶菌酶的來源眾多，其分離純化的方法也有多種。目前主要有直接結(jié)晶法、離子交換層析法、親和層析法以及超濾法、膜色譜法和反膠團(tuán)法等。

2.1 直接結(jié)晶法

結(jié)晶法是提取溶菌酶的傳統(tǒng)方法，原理是在蛋清中加入一定量的中性鹽如氯化物、碘化物或碳酸鹽等鹽類，再調(diào)節(jié)至溶菌酶的等電區(qū)靜置，即可有溶菌酶晶體慢慢析出，而大多數(shù)蛋白質(zhì)卻仍留在溶液中，經(jīng)過濾得溶菌酶結(jié)晶，通過重結(jié)晶可獲得精致的溶菌酶。

此法設(shè)備簡單、操作容易、投資不大。但由于結(jié)晶過程中的條件不易控制，且溶菌酶容易失活，影響質(zhì)量；同時(shí)處理后的蛋清不易回收利用，使成本增大。

2.2 離子交換層析法

離子交換層析法用于溶菌酶分離始于上世紀(jì)8O年代，具有操作簡便、成本低、效率高的特點(diǎn)，并可重復(fù)使用及實(shí)現(xiàn)大規(guī)模連續(xù)自動(dòng)操作，因此而成為溶菌酶生產(chǎn)的常用方法[7]。

通常選擇弱酸性陽離子交換樹脂進(jìn)行分離。目前用于溶菌酶分離純化的離子交換劑主要有Duolite-464、724、732型弱酸性陽離子交換樹脂，D903、D201大孔離子交換樹脂，CM、DEAE-纖維素，羧甲基纖維素（CMC）和羧甲基瓊脂糖，CM.Sephadex陽離子交換樹脂，Duolite C-464樹脂，CM.Toyope.樹脂，大空隙苯乙烯系強(qiáng)堿性陰離子交換吸附樹脂等[6，8]。

2.3 親和層析法

親和層析法是利用蛋白質(zhì)或酶與其配體之間的專一性親和力，使酶與底物形成復(fù)合物，在一定條件下進(jìn)行分離而得到純凈酶的方法。常用的吸附劑為幾丁質(zhì)及其衍生物，如：幾丁質(zhì)粉、羧甲基幾丁質(zhì)、幾丁質(zhì)包埋纖維素、脫氨幾丁質(zhì)粉、N-?；瘹ぞ厶恰⒚摪痹偕鷰锥≠|(zhì)凝膠等[9]。

此法對(duì)各種來源的溶菌酶均可應(yīng)用，對(duì)經(jīng)化學(xué)修飾而失活的溶菌酶也能進(jìn)行分離純化。但僅適用于分離純化微量溶菌酶，大規(guī)模生產(chǎn)尚難以適用。

2.4 超濾

超濾法是一種新興分離純化技術(shù)，是通過控制超濾膜孔徑大小，來濾除雜質(zhì)、水及小分子物質(zhì)，從而達(dá)到分離獲得產(chǎn)物的目的[8]。

超濾法的優(yōu)點(diǎn)是可以獲得高產(chǎn)量和高純度的產(chǎn)品，將超濾法與結(jié)晶法、離子交換法或親和色譜法等結(jié)合使用，可進(jìn)一步提高純度，獲得精制溶菌酶。

2.5 膜色譜法

膜色譜技術(shù)是將膜分離與液相色譜相結(jié)合的一種新型分離技術(shù)，其中親和膜色譜法兼具了膜分離與親和分離的特點(diǎn)，具有純度高，壓降小，分離快等特點(diǎn)，且在分離過程中生物大分子變性幾率小，容易實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)[10]；離子交換膜色譜法則是通過膜介質(zhì)表面的基團(tuán)與目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行離子交換而進(jìn)行分離的，其特點(diǎn)是操作條件溫和，蛋白質(zhì)不容易失活[11]。

2.6 反膠團(tuán)法

反膠團(tuán)萃取是通過在有機(jī)溶劑中加入適量表面活性劑，在溶液中形成的反膠團(tuán)來進(jìn)行分離純化的方法，是近年發(fā)展起來的一種新的萃取方法，為有機(jī)溶劑萃取技術(shù)的應(yīng)用擴(kuò)大了范圍[11]。

3 溶菌酶活性復(fù)性與活性測(cè)定

3.1 溶菌酶的活性復(fù)性

在溶菌酶的生產(chǎn)或應(yīng)用過程中，由于工藝條件或環(huán)境因素的變化，容易造成酶失活變性，因此需要通過采取適當(dāng)措施，保持或恢復(fù)溶菌酶的活性，從而減少損失。如Karuppiah等[12]研究表明，向復(fù)性溶液中加入適量的β-環(huán)糊精，可使變性的碳酸脫水酶的復(fù)性率達(dá)到80%。

3.2 溶菌酶的活性測(cè)定

測(cè)定溶菌酶活性的方法，主要有比濁法、瓊脂板擴(kuò)散法、紫外分光光度法、比色測(cè)定法、瓊脂火箭糖電泳法和高效液相色譜法等。這些方法各有不同特點(diǎn)，其中比濁法和瓊脂板擴(kuò)散法方法較為常用，但干擾因素多，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重現(xiàn)性差。瓊脂火箭糖電泳法和高效液相色譜法的測(cè)定效果最為理想[13]，簡便快速、穩(wěn)定靈敏，測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確可靠，是比較好的方法。在比濁法基礎(chǔ)上改進(jìn)的微量快速比濁檢測(cè)溶菌酶的方法具有快速、準(zhǔn)確、靈敏的特點(diǎn)。

4 溶菌酶的應(yīng)用

4.1 在食品工業(yè)中的應(yīng)用

溶菌酶作為一種無毒、無副作用安全性很高的天然蛋白質(zhì)，成為食品防腐劑和營養(yǎng)保健品的優(yōu)選對(duì)象。現(xiàn)已應(yīng)用于如水產(chǎn)品、乳制品、肉食品、糕點(diǎn)、料酒、清酒及飲料等產(chǎn)品。溶菌酶的殺菌屬于冷殺菌，因此可以避免高溫殺菌對(duì)食品營養(yǎng)和風(fēng)味的破壞作用。將溶菌酶添加到乳粉中，能使牛乳人乳化。

4.2 在生物科學(xué)研究中的應(yīng)用

由于溶菌酶能破壞細(xì)菌細(xì)胞壁，因此用溶菌酶處理格蘭氏陽性細(xì)菌能得到原生質(zhì)體，可用于菌體內(nèi)容物質(zhì)的提取。在適當(dāng)緩沖條件下用溶菌酶處理對(duì)溶菌酶敏感的菌體懸浮液，再經(jīng)超聲波、冷凍、離心分離等方法進(jìn)一步精制，所得的菌體物質(zhì)，可用以提取制造核酸、酶及活性多肽等活性物質(zhì)[14]。隨著生物科學(xué)的發(fā)展，溶菌酶已成為基因工程、細(xì)胞工程、發(fā)酵工程中非常重要的工具酶，對(duì)溶菌酶制劑的需求量也與日俱增 。

4.3 在醫(yī)療中的應(yīng)用

作為酶類抗菌藥，溶菌酶能參與黏多糖的代謝，如配合內(nèi)服與外用藥，可使其對(duì)微生物的感染發(fā)揮出更強(qiáng)的消炎作用。溶菌酶具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤的功效，并具有多種藥理作用，因此廣泛用于副鼻竇炎、咽喉炎、扁平苔蘚的治療。還可用于預(yù)防和治療病毒性肝炎，尤其對(duì)輸血后肝炎及急性肝炎的效果較為顯著。

5 結(jié)論

溶菌酶作為一種天然蛋白質(zhì)，具有抗菌、殺毒和消炎等作用，并能在胃腸內(nèi)促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化與吸收，對(duì)人體沒有毒害，集藥理、保健和防腐3種功能于一體，是一種安全性很高的食品保鮮防腐劑、營養(yǎng)保健品和藥品。

由于溶菌酶來源廣泛，不同來源溶菌酶又有其不同的特殊性，因此，應(yīng)充分研究掌握不同溶菌酶的酶學(xué)特性，同時(shí)研究不同條件如pH值、離子強(qiáng)度等因素對(duì)其活性的影響，探究酶活優(yōu)化條件和調(diào)空方法。另外，作為防腐劑使用溶菌酶時(shí)，應(yīng)先弄清楚是何種微生物導(dǎo)致食品腐敗，以便對(duì)癥下藥，確實(shí)發(fā)揮防腐作用。另外，還應(yīng)研究不同來源溶菌酶之間及與其他物質(zhì)配合使用的協(xié)同作用。

我國溶菌酶的研究、應(yīng)用起步較晚，目前國內(nèi)蛋清溶菌酶年產(chǎn)量不足50t，特別是高活性的溶菌酶供應(yīng)還不能滿足日益增長的需求。我國生物酶工程研究已多次列為國家“863”計(jì)劃及“十五計(jì)劃”等的重點(diǎn)科研攻關(guān)項(xiàng)目。隨著我國經(jīng)濟(jì)的騰飛和生物、化工等工業(yè)的發(fā)展，對(duì)溶菌酶的需求量在不斷增加。因此，研究、開發(fā)和擴(kuò)大溶菌酶的生產(chǎn)有著廣泛的發(fā)展前景。

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