王燈亮 康德智 游鴻海 林章雅 林元相

顱內(nèi)動脈瘤破裂出血是引起蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)最常見的原因，而動脈瘤性SAH的患者中約30% ～90%可發(fā)生腦血管痙攣［1］(cerebral vasospasm，CVS)，是SAH患者死亡和致殘的主要原因。近年來，關(guān)于血小板源性生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)在CVS的作用越來越受人們的關(guān)注。它是在血小板中發(fā)現(xiàn)的一種生長因子，是一種重要的促分裂劑，其中PDGF-BB是最重要的細胞增殖和遷移的趨化因子，在SAH后CVS的發(fā)生過程中，血管內(nèi)皮受損脫落，完整性破壞刺激血管壁PDGF高表達［2］，通過與靶細胞上的血小板源性生長因子受體(Platelet derived growth factor receptor，PDGFR)，而 PDGFR-β 是 PDGFBB的特異性受體。本實驗通過建立兔CVS的動物模型，觀察基底動脈的管徑變化、超微結(jié)構(gòu)和PDGFR-β的表達變化規(guī)律，根據(jù)配體和受體的結(jié)合特點，進一步從側(cè)面反映出PDGFBB在SAH后CVS的作用，為臨床上更好的防治CVS提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 動物及其分組 健康清潔的新西蘭大白兔36只(上海生旺實驗動物養(yǎng)殖有限公司提供)許可證號SCXK(滬)2007-0007，質(zhì)量2.0～2.8 kg，雌雄不限。其中制模導(dǎo)致死亡9只，重新補入實驗動物9只后，隨機分為2組:①對照組:6只。②SAH組:30只。SAH組根據(jù)注血后處死時間，隨機分為注血后1、3、5、7、10 d，共5 組，每組 6 只。

1.2 CVS模型的制備 采用枕大池二次注血法建立穩(wěn)定的兔CVS模型。以鹽酸氯氨酮(30 mg/kg)和鹽酸氯丙嗪(7.5 mg/kg)聯(lián)合行肌內(nèi)注射麻醉，側(cè)臥位枕部常規(guī)消毒后，充分暴露寰枕關(guān)節(jié)間硬脊膜，用2 ml注射器針頭行枕大池穿刺，緩慢釋放腦脊液0.4 ml/kg，同時將未抗凝的等量兔自體耳中央動脈血，緩慢注入枕大池，術(shù)后保持頭低位30 min。對照組用等量的37℃生理鹽水代替動脈血，余處理同上。48 h重復(fù)上述操作，注入的動脈血量為0.2 ml/kg。二次注血后24 h為SAH后第1天，依次類推。

1.3 標本留取方法 將SAH組按照不同時間點、對照組于造模后第5天過量麻醉，充分暴露心臟和主動脈根部，夾閉下腔靜脈和降主動脈，左心室穿入自制灌注針頭，同時剪開右心房放血，用多聚甲醛溶液經(jīng)心臟灌注固定后，開顱取含基底動脈的腦干，置入多聚甲醛固定24 h后，進行組織取材、石蠟包埋、組織切片(與血管橫斷面平行，層厚4 μm)。

1.4 基底動脈直徑測量 每個標本分別切1張切片，行常規(guī)蘇木精-伊紅染色，并通過計算機圖像分析系統(tǒng)(Image-pro plus5.1)，量化分析對照組和SAH各組基底動脈管腔直徑變化。

1.5 透射電子顯微鏡觀察 另取新西蘭大白兔4只，將其隨機分為2組:①對照組(NS組):2只。②SAH組術(shù)后第7天:2只。制模及取材過程大致同上，灌注時采用的是預(yù)冷的2.5%戊二醛溶液。具體過程:3%戊二醛-1.5%多聚甲醛前固定，1%鋨酸-1.5%亞鐵氰化鉀后固定，酒精-丙酮脫水，環(huán)氧樹脂618包埋劑包埋;超薄切片，醋酸鈾、檸檬酸鉛染色，飛利浦208型透射電鏡觀察、攝影。

1.6 PDGFR-β表達的檢測及結(jié)果判斷 一抗:兔抗兔PDGFR-β多克隆抗體，SANTA CRUZ公司;二抗:PV9002，北京中杉金橋生物工程公司。一抗?jié)舛劝?:200稀釋，并嚴格按照兔超敏二步法試劑盒說明進行免疫組化染色。PBS代替一抗作為陰性對照，乳腺癌組織作為陽性對照。采用 Leica DM2500顯微鏡拍照系統(tǒng)(福建醫(yī)科大學(xué)實驗室提供)分別對各組標本基底動脈內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞的PDGFR-β的表達進行觀察，免疫組化染色后細胞質(zhì)中有棕黃色顆粒者為陽性細胞，每個標本分別取3張切片進行免疫組化。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，各組基底動脈直徑的均數(shù)采用單因素方差分析(One-way，AVONA，LSD檢驗)，PDGFR-β的表達情況采用Mann-Whitney U檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基底動脈內(nèi)徑的變化 對照組基底動脈管腔呈圓形或橢圓形，在SAH組的各時間點內(nèi)，基底動脈均發(fā)生了明顯的痙攣，出現(xiàn)管腔直徑的不同程度的縮小(P＜0.01)，在術(shù)后第1天下降明顯(P＜0.01)，隨后有所恢復(fù)，但與對照組相比，第3、5天仍有下降趨勢，在第7天再次明顯收縮(P＜0.01)，第10天時管徑狹窄程度比第7天有所緩解。SAH各組間比較，除第1天與第5天基底動脈直徑無明顯變化(P＞0.05)，其余組間比較，直徑變化比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 各組的基底動脈的管腔直徑(±s，μm)

表1 各組的基底動脈的管腔直徑(±s，μm)

分組(n=6) 對照組 第1天 第3天 第5天 第7天 第10天直徑 871.81±67.50 657.49±27.55 715.32±65.72 618.36±26.61 553.93±51.52 678.45±35.54

2.2 透射電鏡結(jié)果 對照組:血管壁超微結(jié)構(gòu)正常，內(nèi)皮細胞線粒體結(jié)構(gòu)正常，緊密連接呈紡錘形，彈力膜排列整齊，平滑肌細胞、外膜成纖維細胞結(jié)構(gòu)正常。SAH組:血管部分內(nèi)皮細胞脫落，胞漿空泡樣變，緊密聯(lián)接打開，內(nèi)皮間隙擴大;內(nèi)彈力膜扭曲、斷裂;平滑肌細胞變形，排列紊亂，胞漿空泡化;外膜膠原水腫，成纖維細胞增多，可見大量中性粒細胞、單核細胞浸潤。

圖1 -A 對照組:內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)正常，緊密連接正常，平滑肌細胞排列規(guī)則(TEM 8000)

圖1 -B SAH組:內(nèi)皮細胞脫落，緊密連接打開，內(nèi)彈力膜扭曲、斷裂，平滑肌細胞胞漿空泡化，外膜可見大量中性粒細胞、單核細胞浸潤(TEM 8000)

2.3 PDGFR-β的表達情況 根據(jù)文獻［3］，采用量化評分表評價各組的PDGFR-β的表達情況，其免疫組化的陽性反應(yīng)主要在血管內(nèi)皮細胞胞漿，平滑肌和外膜細胞胞漿亦可見，呈棕黃色，胞核無著色。在正常對照組，無陽性細胞表達;在SAH組:第1天開始出現(xiàn)少量陽性細胞，表達較淺;第3天逐漸增多，并在第5、7天達到高峰(P＜0.01)，表達較深;到第10天逐漸下降，但仍高于對照組(P＜0.05)。

圖2 A對照組(400);圖B至圖F(400):依次為SAH術(shù)后第1、3、5、7、10天。黑色箭頭所指為PDGFR-β的陽性細胞(胞漿呈棕黃色，胞核呈藍色)。

3 討論

SAH后CVS的發(fā)病機制十分復(fù)雜，目前認為多種物質(zhì)共同參與了SAH后CVS的發(fā)生，其中PDGF是其中重要的一種［4］。自Borel等［5］報道在因CVS死亡的患者腦脊液中發(fā)現(xiàn)PDGF-AB升高，在鼠痙攣模型中發(fā)現(xiàn)PDGF和細胞增生有關(guān)，而增生可被PDGF拮抗劑抑制的現(xiàn)象后，PDGF在CVS發(fā)生、發(fā)展過程中的作用日益受到人們的關(guān)注。臨床和動物實驗均表明PDGF在血管內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞的表達確實存在于痙攣血管中。

PDGF是結(jié)締組織細胞如成纖維細胞、平滑肌細胞、血管內(nèi)皮細胞等的強有絲分裂原和化學(xué)驅(qū)動劑。目前發(fā)現(xiàn)PDGF家族成員至少有4個，即PDGF-A、B、C和D。PDGF一般以有二硫鍵連接的同源二聚體或異源二聚體組成，如PDGF-AA、BB、CC和DD［6］，尤其PDGF-BB是最重要的細胞增殖和遷移的趨化因子。PDGF生物學(xué)特征主要有三方面:一是促細胞分裂作用，能刺激多種細胞分裂增生。二是化學(xué)趨化性，PDGF對成纖維細胞和平滑肌細胞有趨化性。三是血管收縮效應(yīng)。PDGF與靶細胞膜受體結(jié)合介導(dǎo)動脈壁平滑肌細胞由中膜遷移到內(nèi)膜并增生，在刺激動脈壁平滑肌細胞增殖的同時促進了膠原蛋白的合成與分泌。

表2 SAH后基底動脈的PDGFR-β的表達量化表

PDGF受體包括兩種結(jié)構(gòu)相似酪氨酸激酶受體PDGFR-α、β。PDGFR-α主要在胚胎期神經(jīng)嵴細胞及體節(jié)的發(fā)育過程中其重要作用［7］，而PDGFR-β主要參與血管壁細胞的發(fā)育，具有吸收和促進外膜細胞、平滑肌細胞增殖的作用，在血管形成后期發(fā)揮重要作用［8］。PDGFR-α可與PDGF A、B和C結(jié)合，PDGFR-β可與B和D結(jié)合，受體與PDGF結(jié)合后可發(fā)生二聚化和自身磷酸化反應(yīng)，從而激活幾種特定的細胞內(nèi)分子，引起不同信號傳導(dǎo)通路的級聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生相應(yīng)的病理生理反應(yīng)［9］。

研究表明［10］，在外源PDGF-BB注入蛛網(wǎng)膜下腔后，腦血管痙攣是逐漸的加重的過程，吳軍等［11］在大鼠CVS模型中證實了PDGF mRNA轉(zhuǎn)錄和PDGF-BB蛋白表達增強與SAH后CVS的血管增生性變化有關(guān)。因此在SAH后痙攣血管的PDGF-BB表達升高，與CVS的發(fā)生密切有關(guān)，而PDGFR-β與PDGF-B鏈有高親和力［12］，后者許多生理作用的有效發(fā)揮，需要結(jié)合PDGFR-β，因此在SAH后CVS的發(fā)生中可能伴隨著PDGFR-β表達的上調(diào)。但目前未見有對PDGFR-β在CVS的痙攣血管中表達時間窗的相關(guān)研究。

本實驗通過兔枕大池二次注血法建立兔CVS模型，結(jié)果提示兔CVS模型的血管痙攣現(xiàn)雙相期改變，急性腦血管收縮出現(xiàn)在第1天，隨后逐漸緩解，而遲發(fā)性CVS在第3天左右出現(xiàn)，在第7天達到高峰后逐漸緩解，與臨床上SAH患者出現(xiàn)CVS的時相基本一致。同時，透射電鏡示SAH組的基底動脈出現(xiàn)相應(yīng)的超微結(jié)構(gòu)變化，這均表明實驗?zāi)Ｐ偷闹谱魇浅晒Φ?。本實驗?yīng)用免疫組化技術(shù)觀察PDGFR-β在SAH后血管壁的表達情況，發(fā)現(xiàn)在正常對照組的血管壁上無陽性細胞表達，在SAH后第1天開始出現(xiàn)少量陽性細胞，第3天逐漸增多，在第5、7天達到高峰后，第10天逐漸下降，表達部位主要在血管內(nèi)皮細胞上，平滑肌和外膜亦可見有表達，規(guī)律呈現(xiàn)一定的時序性，且其表達時相與管腔狹窄程度的結(jié)果基本一致。由此可見，PDGFR-β可能與SAH后CVS的發(fā)生有關(guān)，而SAH后PDGFR-β的表達上調(diào)可能是與其配體的作用相適應(yīng)，放大了PDGF對痙攣血管的生理作用，引起CVS的發(fā)生。

在SAH后的初期，大量血凝塊激活血小板等釋放出血管收縮物質(zhì)，如PDGF、內(nèi)皮素等，這些縮血管物質(zhì)作用于腦血管，引起早期的CVS病理改變，此時應(yīng)用血管擴張劑(罌粟堿、尼莫地平等)可在一定程度上緩解CVS。更為重要的是，PDGF還可以作為游走趨化因子，在基底動脈內(nèi)長期高表達，并作用于平滑肌細胞，使平滑肌細胞表型的轉(zhuǎn)化，刺激血管平滑肌細胞增殖分化，引起腦血管重構(gòu)，管壁增厚，血管順應(yīng)性下降［13］，從而參與整個腦血管痙攣的病理變化過程。而此時痙攣血管壁的病理變化為器質(zhì)性的，對血管擴張劑的反應(yīng)較差。

綜上所述，本實驗通過研究PDGFR-β在CVS痙攣血管的表達規(guī)律，進一步從側(cè)面反映出PDGF-BB是SAH后CVS發(fā)生的一種重要的致痙作用，然而，目前關(guān)于PDGF-BB在CVS中的具體作用機制尚不明確，有待于今后進一步更好的研究。目前，已有研究認為［14］，SAH后早期使用PDGF抑制劑Trapidil，可有效抑制PDGF及其受體的活性，減輕PDGF對平滑肌的增殖及遷移作用，從而改善痙攣血管的器質(zhì)性病理改變，這為臨床上更有效的預(yù)防CVS的發(fā)生提供了思路。

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