榮 健 葉 升 梁孟亞 劉 海 陳光獻 黃偉明 吳鐘凱*

1(中山大學附屬第一醫(yī)院麻醉科，廣州 510000)

2(中山大學附屬第一醫(yī)院腫瘤科，廣州 510000)

3(中山大學附屬第一醫(yī)院心外科，廣州 510000)

引言

肺缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)引起的肺功能障礙，是體外循環(huán)心臟手術后最常見的并發(fā)癥和導致死亡的主要原因之一[1]。研究表明，控制性再灌注具有圍缺血期器官保護作用[2]。氧控制性再灌注可抑制心臟受損，提高再灌注后心臟功能[3]。但在肺缺血再灌注損傷方面，控制性再灌注研究多集中于離體肺或肺移植領域，在體外循環(huán)肺缺血再灌注損傷領域未見研究。

體視學根據(jù)平面(二維)圖像數(shù)據(jù)，通過數(shù)理統(tǒng)計方法，推導出反映空間(三維)結構參數(shù)，屬于定量分析方法。本研究根據(jù)體視學方法評估氧控制性再灌注對體外循環(huán)肺缺血再灌注早期損傷的作用，尋求體外循環(huán)肺缺血再灌注損傷的保護措施。相關研究國內外未見報道。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康犬 14只，雌雄不限，體重(19.2±3.09)kg，廣州白云區(qū)穗北實驗動物養(yǎng)殖場提供。依據(jù)體外循環(huán)中吸入氧濃度方案的不同，隨機分為缺血再灌注組(IR組)和氧控制性再灌注組(OCR組)，每組7只。IR組全程FiO280%;OCR組在主動脈開放即刻調整 FiO2至40%，隨后每5 min依次上調10% ，最后達80% ，其余時段均維持FiO280% 。

1.2 麻醉方法及手術過程

肌肉注射氯胺酮40 mg/kg(福建古田藥業(yè)有限公司)和芬太尼 2 μg/kg(宜昌人福藥業(yè)有限公司)，靜脈注射維庫溴銨0.1 mg/kg(浙江仙琚制藥股份有限公司)行氣管插管，呼吸機(BIRD VELA，Model 606 A，USA)維持機械呼吸(潮氣量 13～15 mL/kg，呼吸頻率12～16次/min)，股動、靜脈分別插管測平均動脈壓(mean arterial pressure，MAP)及中心靜脈壓(central venous pressure，CVP)。胸骨正中劈開，切開心包，右心房內注射肝素3 mg/kg，主動脈和上下腔靜脈分別插入16 F和18 F(Edwards Lifesciences LLC，Irvine，USA)插管，連接人工心肺機。升主動脈根部插入并固定16號針頭，連接灌注裝置。采用3 M人工心肺機，Medtronic膜肺(AFFINITY NT 541，Medtronic Inc.，USA)，Sarns變溫水箱(Sarns Heater/Cooler，Ann Arbor，MI)，以及東莞科威醫(yī)療儀器廠的塑料管道。兩組均以犬血部分預充。

1.3 CPB管理

兩組犬 CPB開始后，維持流量50～80 mL·min-1·kg-1，并體循環(huán) 10 min，阻斷升主動脈后，在主動脈根部灌注 4℃改良 ST.Tomas停跳液 15 mL/kg，阻斷升主動脈60 min后開放升主動脈，開放后輔助循環(huán)90 min。在開放主動脈后，如心臟出現(xiàn)室顫，則使用交流電除顫復跳。

1.4 標本采集及指標檢測

在開胸后即刻(T1)、主動脈開放25 min(T2)、主動脈開放90 min(T3)留取肺標本，部份以5%的福爾馬林液固定，石蠟包埋，切片HE染色;部份進行W/D測定。

1.5 分析方法和圖像分析軟件

病理標本HE染色。每張切片在40倍物鏡下隨機選取10個視野，經(jīng)Leica顯微攝像系統(tǒng)輸入計算機，用 Image-Pro圖像分析軟件進行測試。測試前，首先用物鏡測微尺對該軟件進行標定。

1.6 體視學參數(shù)的選擇和計算

選用的測量參數(shù)有：肺泡間隔中性粒細胞(polymorphonuclear neutrophil，PMN)計數(shù)、肺泡間隔面積密度(area and density of pulmonary alveolar septum，PASAD)、肺泡腔體積密度和肺實質紅細胞體積密度。根據(jù) Image-Pro圖像分析軟件的測試結果，按體視學公式計算出上述參數(shù)[4]。

1.7 肺組織濕重與干重比值

肺組織于4℃生理鹽水中漂洗，剔除結締組織，用濾紙吸干表面液體，稱濕重;然后置于80℃烘箱中48 h去除水分，再稱干重，計算濕干重比(W/D)。

1.8 統(tǒng)計分析

所有計量數(shù)據(jù)運用均數(shù)±標準差進行統(tǒng)計描述分析，計數(shù)數(shù)據(jù)運用百分位數(shù)進行統(tǒng)計描述分析。為檢驗組間差異，對計數(shù)數(shù)據(jù)(discrete variable)進行組間比較，采用多個獨立樣本非參數(shù)檢驗(K independent samples test);對計量數(shù)據(jù) (measurement data)，采用單因素方差分析(AVON)。對重復測量數(shù)據(jù)比較采用重復測量數(shù)據(jù)的方差分析(repeated measures analysis of variance)，P＜0.05認為有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 光學顯微鏡檢查

圖1為IR和OCR兩組的肺損傷比較，兩組犬肺組織在主動脈開放后均出現(xiàn)炎性細胞滲出、肺間質水腫、肺間隔增厚等病理改變，但 OCR組組織病理學損傷程度相對較輕。按 Arold SP方法[5]對肺損傷進行5級分類：0=最小損傷，1=輕度損傷，2=中度損傷，3=嚴重損傷，4=極度損傷。400倍光鏡下任取10個視野，計算平均每個視野所得分均值代表損傷程度。T2時點兩組肺損傷評分：(3.8±0.5)vs(2±0.7)，P ＜0.05;T3時點兩組肺損傷評分：(4.2 ±0.8)vs(2.6 ±0.6)，P ＜0.05。

圖1 兩組肺損傷比較(HE stain，40×)。(a)IR組 T1;(b)IR組 T2;(c)IR組 T3;(d)OCR組T1;(e)OCR組T2;(f)OCR組T3Fig.1 Lung injuries(HE staining of lung sections，40 × ).(a)IR group T1;(b)IR group T2;(c)IR group T3;(d)OCR group T1;(e)OCR group T2;(f)OCR group T3

2.2 肺泡間隔中性粒細胞(PMN)計數(shù)及肺泡間隔面積密度(PASAD)測定

表1為IR和OCR兩組肺泡間隔中性粒細胞計數(shù)和肺泡間隔面積密度的比較。兩組肺泡間隔中性粒細胞計數(shù)和肺泡間隔面積密度均逐漸上升，但在T2和T3時點，OCR組較IR組明顯降低，P＜0.05。

表1 肺泡間隔中性粒細胞計數(shù)和肺泡間隔面積密度Tab.1 PMN count，the area and density of pulmonary alveolar septum of two groups

2.3 各組肺泡腔的體積密度

表2為IR和OCR兩組肺泡腔體積密度的比較，可見兩組肺泡腔體積密度均逐漸下降，但在T2和T3時點，OCR組較IR組明顯增大，P＜0.05。

表2 兩組肺泡腔體積密度Tab.2 Volume density of alveolus of two groups

2.4 各組肺組織紅細胞的體積密度

表3為IR和OCR兩組肺組織紅細胞體積密度的比較，可見這兩組密度均逐漸上升，但在T2和T3時點，OCR組較IR組明顯降低，P＜0.05。

表3 兩組肺組織紅細胞體積密度Tab.3 Volume density of the erythrocyte in the lung of two groups

2.5 肺組織W/D比較

與T1相比，IR組和 OCR組 W/D在 T2、T3時點均明顯增高(P＜0.05);兩組相比，OCR組 W/D在T2、T3時點明顯低于IR組相應時點(P＜0.05)。兩者比較見圖2。

圖2 兩組肺干濕重比較(*組間比較，P＜0.05;△與組內T1比較，P＜0.05)Fig.2 W/D weight in the two groups(* compared between the two groups，P ＜0.05.△ compared with T1 in the group，P ＜0.05.)

3 討論

3.1 體視學方法評估體外循環(huán)肺缺血再灌注早期損傷

形態(tài)結構的改變是功能變化的基礎，而功能變化反過來又影響其形態(tài)結構。體視學是“通過二維圖像的定量分析獲取數(shù)據(jù)以定量描述三維幾何，并在微觀組織分析中加以應用的方法”[6]，應用這種方法可以對肺實質急性損傷進行定量分析。

當肺泡受損時，炎癥細胞(特別是中性粒細胞)聚集，肺泡間隔增厚并，有炎癥細胞浸潤。肺泡間隔中性粒細胞計數(shù)愈大，提示炎癥程度愈厲害。肺泡間隔面積密度，是指在單位面積肺實質中，肺泡間隔所占的比例。肺泡腔的體積密度，是指單位體積的肺實質中肺泡腔所占的體積。當肺實質由于炎癥、水腫、滲出、出血等原因導致肺泡腔體積減小時，肺泡腔體積密度會降低，其體積密度的變化隨著肺實質炎性滲出的增多而減小。肺泡紅細胞的體積密度，是指單位體積的肺實質中紅細胞所占的體積。當肺組織因炎癥或其他因素導致肺組織出血、充血時，其體積密度會增加。肺組織的病變越重，出血、充血越明顯，其體積密度越大。本實驗檢測了體視學指標及反映肺損傷的濕干重比，發(fā)現(xiàn)體外循環(huán)肺缺血再灌注早期即有損傷出現(xiàn)，這與肺損傷五級評分結果相符。

3.2 體視學方法評估氧控制性再灌注的肺保護作用

肺損傷是臨床體外循環(huán)術后最主要的并發(fā)癥之一，其發(fā)病率高達15% ～30%[7]，肺缺血再灌注是其主要原因之一[1]。再灌注后氧供突然增加，在線粒體細胞色素P450系統(tǒng)作用下，產(chǎn)生大量毒性氧代謝產(chǎn)物;并且在再灌注大量氧供下，缺氧通過 p38 MAPK途徑激活的黃嘌呤氧化酶產(chǎn)生大量ROS。這些活性氧代謝產(chǎn)物導致器官損傷。因此，再灌注期逐漸恢復氧供可減少ROS的產(chǎn)生，具有器官保護作用。有研究報道，氧控制性再灌注可保護肺血管內皮功能，減輕全身缺血再灌注導致的急性肺損傷[2];減輕腦 、小腸缺血再灌注損傷，抑制炎性反應[8-9];維持全身缺血再灌注時血流動力學的穩(wěn)定[10]。無資料提示體外循環(huán)期間控氧對肺缺血再灌注損傷的作用。本實驗將氧控制性再灌注應用于犬體外循環(huán)肺缺血再灌注模型，通過體視學定量方法來評價肺組織炎性細胞浸潤、肺微血管通透性、肺組織充血出血，發(fā)現(xiàn)氧控制性再灌注可減輕體外循環(huán)肺缺血再灌注早期肺組織滲出，抑制中性粒細胞。結果表明，再灌注早期控制氧供可改善肺損傷的嚴重程度，但臨床實施方案及遠期效果有待進一步的研究。

3.3 體視學方法評估體外循環(huán)肺損傷的優(yōu)勢與精確性

二維定量研究是目前評價肺損傷的重要方法。但是，傳統(tǒng)定量方法是在所要研究區(qū)域內任意選擇少量的“典型”部位，運用二維定量技術對所研究的參數(shù)進行二維定量研究，但缺乏隨機抽樣。而體視學方法是基于二維切片的全面觀察而獲得顯微結構的三維定量信息的精確手段，因此成為連接分子生物學和形態(tài)學研究、功能研究的橋梁，被《老年神經(jīng)生物學》、《比較神經(jīng)科學雜志》等國際雜志指定為定量方法。本研究采用體視學定量方法來評價體外循環(huán)肺缺血再灌注損傷及氧控制性再灌注的肺保護作用，與應用其他評價方法(髓過氧化物酶、丙二醛等)的意義相同[11]，表明體視學定量方法評價體外循環(huán)肺損傷具有一定的精確性，但臨床應用需要進一步驗證。

4 結論

通過體視學檢測，結合組織學評分，發(fā)現(xiàn)在體外循環(huán)再灌注早期即可出現(xiàn)肺損傷表現(xiàn)，而在此階段給予合適的控氧，可以達到一定的肺保護目的。但是，臨床的實施需要更加深入的研究。

[1]Egan JR，Butler TL，Cole AD，et al.Myocardial ischemia is more important than the effects of cardiopulmonary bypass on myocrdial water handling and postoperative dysfunction：a pediatric animal model[J].J Thorac Cardiovasc Sur，2008，136(5)：1265-1273.

[2]Munakata H，Okada K，Kano H，，et al.Controlled earlier reperfusion for brain ischemia caused by acute type A aortic dissection.[J].Ann Thorac Surg，2009，87(4)：e27-e28.

[3]Serviddio G，Di Venosa N，F(xiàn)ederici A，et al.Brief hypoxia before normoxic reperfusion(postconditioning)protects the heart against ischemia-reperfusion injury by preventing mitochondria peroxyde production and glutathione depletion[J].FASEB J，2005，19(3)：354-361.

[4]申洪，沈忠英.實用生物體視學技術[M].廣州：中山大學出版社，1991

[5]Arold SP，Mora R，Lutchen KR，et al.Variable tidal volume ventilation improves lung mechanics and gas exchange in a rodent model of acute lung injury[J].Am J Respir Crit Care Med，2002，165(3)：366-371.

[6]Manoonkitiwongsa PS，Mcmillan PJ，Schultz RL，et al.A simple stereologic method for analysis of cerebral cortical microvessels using image analysis[J].Brain Res Brain Res Protoc，2001，8(1)：45-47.

[7]Messent M，Sullivan K，Keogh BF，et al.Adult respiratory distress syndrome following cardiopulmonary bypass：incidence and prediction[J].Anesthesia，1992，47(3)：267-268.

[8]Douzinas EE，Patsouris E，Kypriades EM，et al.Hypoxaemic reperfusion ameliorates the histopathological changes in the pig brain after a severe global cerebral ischaemic insult[J].Intensive Care Med，2001，27(5)：905-910.

[9]Douzinas EE， Kollias S， Tiniakos D， et al. Hypoxemic reperfusion after 120 min of intestinal ischemia attenuates the histopathologic and inflammatory response[J].Crit Care Med，2004;32(11)：2279-2283.

[10]Douzinas EE，Livaditi O，Andrianakis I，et al.The effect of hypoxemic resuscitation from hemorrhagic shock on blood pressure restoration and on oxidative and inflammatory responses[J].Intensive Care Med，2008;34(6)：1133-1141.

[11]榮健，王治平，吳鐘凱，等.氧控制性再灌注抗犬體外循環(huán)肺缺血再灌注早期損傷[J].中山大學學報(醫(yī)學科學版)，2009;30(6)：686-690.