胡建立 李 健 李 靜 馬 杰 陳 斌 趙春華*

1(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，北京 100005)

2(清華大學(xué)第一附屬醫(yī)院，北京 100016)

引言

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal ctem cells，MSCs)，是一群存在于身體各個(gè)組織內(nèi)具有貼壁能力的多潛能干細(xì)胞，具有成骨、成脂肪、成軟骨和成肌等的分化能力，具有很強(qiáng)的應(yīng)用潛能[1-4]，研究最多的是具有取材方便、擴(kuò)增迅速、可自體移植并具有多向分化潛能等特點(diǎn)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)。BMSCs可以穩(wěn)定和修復(fù)造血微環(huán)境，促進(jìn)造血干細(xì)胞增殖、分化，調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞免疫功能，減輕移植排斥反應(yīng)，因此具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法通常采10%～15%的胎牛血清作為營養(yǎng)支持，但由于臨床應(yīng)用中增加了病毒感染及異種蛋白所致的異基因免疫應(yīng)答可能及倫理學(xué)問題，嚴(yán)重制約了其臨床應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)通過研究在與以往不同的培養(yǎng)基中擴(kuò)增BMSCs的分化潛能，探索一種完全不加動物源性產(chǎn)品的符合臨床需要的人BMSCs體外培養(yǎng)體系，為組織工程產(chǎn)品用于臨床奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

Ficoll分離液(比重 1.077 g/mL，Pharmacia 公司)，細(xì)胞培養(yǎng)液有L-DMEM、IMDM、DF12(GibcoBRL公司);胎牛血清(Hyclone公司);膠原酶、胰蛋白酶、谷氨酰胺(GibcoBRL公司);β-巰基乙醇(Merck公司)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblastic growth factor，bFGF;Sigma公司)、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子 (vascular endothelial growth factor，VEGF;Sigma公司)、表皮細(xì)胞生長因子 (epidermal growth factor，EGF;Gibco公司)、血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor BB，PDGF-BB;Sigma公司)、地塞米松(Sigma公司)、β-甘油磷酸鈉(Sigma 公司)、抗壞血酸(Sigma 公司)、1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤(Sigma公司)、人凝血酶(上海萊士血制品有限公司)，骨髓(解放軍307醫(yī)院)、AB型臍帶血漿(北京市臍帶血造血干細(xì)胞庫)、AB型血清(健康志愿者)。所有標(biāo)本均來自簽訂知情同意書的捐獻(xiàn)者。

1.2 方法

1.2.1 從健康成人全血中制備血清

無菌采集AB型健康志愿者靜脈血15 mL，室溫靜置 30 min，1500 r/min，離心 15 min，將上清10份混勻，56℃水浴箱 30 min，0.22 μm 濾器過濾除菌，8 mL/支分裝，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 成人BMSCs分離

無菌采集健康志愿者的骨髓10 mL，用D-Hanks液適當(dāng)稀釋，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度107/mL，離心管內(nèi)Ficoll和細(xì)胞懸液，比例為1∶1，1500 r/min室溫離心20 min，無菌吸取白膜層(含單個(gè)核細(xì)胞)，DHanks液洗滌2次，計(jì)數(shù)。

1.2.3 成人BMSCs培養(yǎng)

單個(gè)核細(xì)胞以1×106/cm2接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)體系：58%DMEM/F12+40%MCDB-201、2%AB 型成人血清(AS-AB)]、10 ng/mL EGF、10 ng/mL PDGF，1 × 胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸、1 ×亞油酸-牛血清白蛋白，50 μmol/L β 巰基乙醇，2 mmol/L L-谷氨酰胺，100 μg/mL青霉素和 100 U/mL硫酸鏈霉素。37℃、5%CO2、95%濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 h后，去除懸浮細(xì)胞，補(bǔ)充培養(yǎng)基，每3 d換液1次，待細(xì)胞長至70% ～80%匯合時(shí)，0.125%胰蛋白酶 -0.01%EDTA 消化傳代[5-6]。

1.2.4 多向分化潛能

分別取第三代、第七代的BMSCs誘導(dǎo)。

1)成骨分化。BMSCs在含有10-7mol/L地塞米松、10 mmol/L β-磷酸甘油、0.05 mmol/L抗壞血酸和10%FCS的IMDM中誘導(dǎo)培養(yǎng)，每3 d半量換液一次。

2)成骨分化的檢測。堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)染色試劑盒染色。具體步驟按照試劑盒操作如下：配制作用液;傾出培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，PBS洗細(xì)胞2次;加固定液2 mL/皿，室溫固定1 min，流水漂洗2 min;加作用液2 mL/皿，置濕盒內(nèi)于37℃孵育2 h，流水沖洗2 min;加5號液2 mL/皿，復(fù)染5 min，流水沖洗2 min;70%甘油封固，倒置顯微鏡下觀察，胞漿出現(xiàn)藍(lán)紫色沉淀的為陽性細(xì)胞。

3)VonKossa染色。中性甲醛溶液固定1 h，去離子水洗凈后，加入2%硝酸銀溶液，37℃避光反應(yīng)10 min，去離子水沖洗后曝光15 min，光鏡下觀察鈣化基質(zhì)沉淀。對照細(xì)胞為在擴(kuò)增培養(yǎng)基中培養(yǎng)的BMSCs細(xì)胞。

4)成脂肪分化。BMSCs在含有10-6mol/L地塞米 松、 0.5 mmol/L 3-isobutyl-1-methylxanthine(IBMX)、0.1 mmol/L抗壞血酸和 10%FCS的 IMDM中誘導(dǎo)培養(yǎng)，每3 d半量換液一次。顯微鏡下觀察脂肪滴的形成。

5)成脂肪分化的檢測，油紅O染色。細(xì)胞以中性甲醛固定10 min后，蒸餾水沖洗;油紅O染色工作液作用5 min;明礬蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，1 min，蒸餾水沖洗;甘油明膠封片，顯微鏡下觀察并照相。脂滴紅染，胞核藍(lán)色。對照細(xì)胞為在擴(kuò)增培養(yǎng)基中培養(yǎng)的BMSCs細(xì)胞。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs的分離培養(yǎng)

原代培養(yǎng)中，在接種后數(shù)小時(shí)即可見部分細(xì)胞貼壁，貼壁細(xì)胞開始基本呈圓形。3 d后，貼壁細(xì)胞明顯增多，并逐漸伸展成為紡錘形。換液棄去未貼壁的細(xì)胞，貼壁細(xì)胞形態(tài)為成纖維樣細(xì)胞，呈梭形，散在生長，分布不均勻。7 d時(shí)，細(xì)胞基本貼滿培養(yǎng)瓶底部，呈魚群狀、漩渦狀、網(wǎng)狀或輻射狀排列。原代培養(yǎng)9 d左右，非貼壁細(xì)胞基本全部去除，貼壁細(xì)胞形態(tài)較為一致，可進(jìn)行第1次傳代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)的BMSCs在形態(tài)學(xué)上更加趨于一致，為成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，生長旺盛。

2.2 成骨誘導(dǎo)的結(jié)果

2.2.1 堿性磷酸酶染色

擴(kuò)增后不同代次的BMSCs(P3、P7)在成骨誘導(dǎo)體系中培養(yǎng)4～5 d，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，細(xì)胞由原來的成纖維細(xì)胞樣變?yōu)槎嘟切?。誘導(dǎo)l周，80%以上的細(xì)胞為不規(guī)則形;誘導(dǎo)2周，細(xì)胞間相互融合。堿性磷酸酶染色顯示，陽性細(xì)胞(成骨細(xì)胞)胞漿內(nèi)出現(xiàn)沉淀(見圖1(b)、(d)，箭頭所指)，而對照組細(xì)胞未能出出現(xiàn)陽性(見圖1(a)、(c))。在2%的成人AB型血清添加的擴(kuò)增體系中擴(kuò)增的BMSCs，第三代、第七代仍然具有很好的成骨分化潛能，可以誘導(dǎo)分化成成骨細(xì)胞。

圖1 ALP染色結(jié)果(40×，箭頭所指為陽性)。(a)P3陰性對照;(b)P3第三代;(c)P7陰性對照;(d)P7第七代Fig.1 ALP staining (40 × ， arrows indicate the positive).(a)P3 negative control;(b)P3 the third generation;(c)P7 negative control;(d)P7 the seventh generation

2.2.2 Vonkossa染色

擴(kuò)增后不同代次的BMSCs(P3、P7)經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)3周，Vonkossa銀染色后，鈣鹽沉積區(qū)域呈黑色(見圖2(b)、(d)，箭頭所指)，而對照組細(xì)胞同樣染色處理未見明顯鈣鹽沉積(見圖2(a)、(c))。在2%的成人AB型血清添加的擴(kuò)增體系中擴(kuò)增的BMSCs，第三代、第七代仍然具有很好的成骨分化潛能，可以誘導(dǎo)分化成成骨細(xì)胞。

圖2 Vonkossa染色(20×，箭頭所指為鈣基質(zhì)沉積)。(a)P3陰性對照;(b)P3第三代;(c)P7陰性對照;(d)P7第七代Fig.2 Vonkossa staining (20 × ， arrows indicate calcium matrix deposition).(a)P3 negative control;(b)P3 the third generation;(c)P7 negative control;(d)P7 the seventh generation

2.3 成脂誘導(dǎo)

兩組不同代次的 BMSCs(P3、P7)，在加入脂肪誘導(dǎo)體系后約7 d，少數(shù)細(xì)胞內(nèi)就出現(xiàn)微小明亮的脂肪滴。隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長，BMsCs體積變大，呈橢圓形，胞內(nèi)正常結(jié)構(gòu)消失，呈現(xiàn)空泡結(jié)構(gòu)和大量脂肪油滴。培養(yǎng)至2周，融合的脂肪滴幾乎充滿整個(gè)細(xì)胞，油紅O染色呈陽性(見圖3(b)、(d)，箭頭所指)。對照級細(xì)胞于培養(yǎng)第7 d即鋪滿瓶底，鏡下觀察呈成纖維樣整齊排列，未發(fā)生形態(tài)改變，經(jīng)油紅O染色、蘇木素復(fù)染后，胞漿未見明顯脂肪滴(見圖3(a)、(c))。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：在2%的成人 AB型血清添加的擴(kuò)增體系中擴(kuò)增的 BMSCs，第三代、第七代仍然具有很好的成脂分化潛能，可以誘導(dǎo)分化成脂肪細(xì)胞。

3 討論和結(jié)論

圖3 油紅O染色(20×，箭頭所指為油紅O染色陽性)。(a)P3陰性對照;(b)P3第三代;(c)P7陰性對照;(d)P7第七代Fig.3 Oil red O staining(20 × ，arrows indicate the positive of oil red O staining).(a)P3 negative control;(b)P3 the third generation;(c)P7 negative control;(d)P7 the seventh generation

隨著干細(xì)胞工程及其相關(guān)生物技術(shù)研究的發(fā)展，以及對干細(xì)胞本身特性的認(rèn)識，使得研究者在體外培養(yǎng)人BMSCs、體外定向誘導(dǎo)分化為所需的不同細(xì)胞成為可能。BMSCs作為干細(xì)胞，具有多向分化潛能、自我更新特點(diǎn)，具有獨(dú)特的來源以及簡便的分離培養(yǎng)方法，被認(rèn)為是有臨床應(yīng)用價(jià)值的組織工程種子細(xì)胞。BMSCs與其他干細(xì)胞相比，具有顯著的優(yōu)越性：第一，骨髓易于獲得，在同一個(gè)體可多次抽取;第二，具有多向分化潛能，體外易于分離純化、增殖;第三，可進(jìn)行自體移植，避免了倫理道德和免疫排斥的困擾。

目前，針對體外擴(kuò)增人BMSCs的傳統(tǒng)方法主要是應(yīng)用10%～15%的胎牛血清作為主要的血清添加，但是異種或異體蛋白對人體細(xì)胞的負(fù)面影響阻礙了其擴(kuò)增產(chǎn)品、組織工程產(chǎn)品的臨床推進(jìn)。

近年來，針對體外擴(kuò)增人的BMSCs培養(yǎng)基的血清替代品，所進(jìn)行的研究已經(jīng)很多。本小組已系統(tǒng)地比較了在2%的AB型健康成人血清、臍帶血清、胎牛血清所制得的培養(yǎng)基中BMSCs的生長特性[7]，證實(shí)了2%的AB型健康成人血清可以代替胎牛血清在體外有效地?cái)U(kuò)增BMSCs。在本試驗(yàn)中，繼續(xù)研究2%成人AB型血清配制的培養(yǎng)基中BMSCs的分化潛能。

Friedenstein的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，通常情況下10%人血清的生長狀況好于10% 胎牛血清的生長狀況。Anselme等、Yamamoto等和Spees等認(rèn)為，人血清與胎牛血清相當(dāng)[8-10]。Oreffo et al等認(rèn)為，在培養(yǎng)的產(chǎn)物中，人血清在誘導(dǎo)成骨、成脂方面優(yōu)于胎牛，而Yamamoto等報(bào)道成骨能力方面二者類似，Anselme等在無胎牛血清的擴(kuò)增培養(yǎng)體系中加入15%的AB血清或自體血漿[8]。Mizuno等認(rèn)為，擴(kuò)增BMSCs人的自體血清要遠(yuǎn)優(yōu)于胎牛血清[11]。有結(jié)果顯示，適度低血清用量有利于細(xì)胞生長[12]。本實(shí)驗(yàn)中采取的是只添加了2%的人源化AB型血清，通過觀察第三、第七代次的 BMSCs的分化潛能，發(fā)現(xiàn)仍然具有很好的成骨成脂潛能。實(shí)驗(yàn)說明，在該配方中，2%的血清添加就達(dá)到了與以往10%～15%的血清添加的相同效果，可以消除以動物源性的血清(如胎牛血清)或蛋白為添加因子、外源性蛋白被細(xì)胞內(nèi)化而引起的許多潛在問題，如病毒、朊病毒的感染免疫排斥反應(yīng)[13]。

本研究顯示，培養(yǎng)基中以2%的成人AB型血清添加擴(kuò)增 BMSCs，至少能和胎牛血清是一樣的效果，證實(shí)獲得的 BMSCs保持有分化潛能，確實(shí)可以向成骨、成脂方向成功分化。在不改變擴(kuò)增效率的情況下，通過降低培養(yǎng)基中血清的濃度，大大降低了擴(kuò)增成本。

有關(guān)培養(yǎng)基的進(jìn)一步優(yōu)化尚待更進(jìn)一步研究，以期為找到一種可以很好替代胎牛血清用于有效擴(kuò)增并達(dá)到臨床治療用量的細(xì)胞產(chǎn)品的血清[14]，實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增體系的完全人源化。

BMSCs高度的自我更新能力和強(qiáng)大的可塑性以及取材方便、低免疫原性，使其成為組織工程中理想的種子細(xì)胞。許多研究者以其為種子細(xì)胞，在骨、軟骨、肌腱損傷的修復(fù)方面做了較深入的研究，如關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)的促進(jìn)、骨損傷的修復(fù)等都取得了可喜的成果，預(yù)示著BMSCs在組織工程方面巨大的應(yīng)用價(jià)值。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有望作為種子細(xì)胞與支架材料，在復(fù)合之后移植到創(chuàng)傷部位修復(fù)骨缺損[15]，具有作為軟骨組織工程種子細(xì)胞來源的可能[16]。有學(xué)者將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞直接注射到梗死區(qū)或經(jīng)靜脈注射后，在損傷區(qū)均能見到骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并分化成為心肌細(xì)胞，使心功能得到明顯改善，還能預(yù)防有害的重構(gòu)[17-18]。研究表明，在適當(dāng)?shù)臈l件下，人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能向神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等分化，可以在體外經(jīng)過擴(kuò)增誘導(dǎo)后作為神經(jīng)細(xì)胞移植的供體，為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療開辟一條新的途徑[9]。

總之，BMSCs作為一種在組織工程中有著廣闊應(yīng)用前景的干細(xì)胞，其實(shí)驗(yàn)研究如火如荼，其中包括培養(yǎng)條件、定向分化等研究，目前國內(nèi)外已有部分實(shí)驗(yàn)室和醫(yī)療機(jī)構(gòu)在進(jìn)行小規(guī)模的臨床實(shí)際應(yīng)用的論證。相信在前期基礎(chǔ)研究準(zhǔn)備完善后，大規(guī)模臨床應(yīng)用就要到來，希望本研究對此有一定的幫助。

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