李洪波， 朱辛明， 宋玉國， 熊 英， 王 萍

病理狀態(tài)下的血小板黏附、激活、聚集形成的動(dòng)脈粥樣硬化被認(rèn)為是腦梗死(cerebral infaretion，CI)的重要致病因素之一?；罨癄顟B(tài)下的血小板膜糖蛋白CD41/CD61復(fù)合物能表達(dá)多種血小板受體功能，與纖維蛋白原、血管性血友病因子(vWF)、纖維連接蛋白、?；Y(jié)合素等粘連性蛋白結(jié)合形成異二聚體，在血小板聚集中起著關(guān)鍵作用。本實(shí)驗(yàn)采用病例-對照的方法，研究血小板膜糖蛋白CD41/CD61的基因多態(tài)性及其表達(dá)率，探討血小板膜糖蛋白CD41/CD61與腦梗死的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

腦梗死組及對照組均來自吉林地區(qū)，漢族人。腦梗死組均為我院確診的腦梗死首發(fā)住院患者115例，其中男64例，女51例，年齡36～77歲，平均63±11歲。符合1995年全國第四次腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議制定的腦梗死診斷標(biāo)準(zhǔn)，均經(jīng)頭顱CT或MR證實(shí)有相關(guān)責(zé)任病灶;排除既往腦出血、心肌梗死、冠心病、心臟瓣膜病、糖尿病等病史。對照組103例，均為同期門診健康體檢者，其中男59例，女44例，年齡33～79歲，平均61±10歲。

1.2 標(biāo)本的采集

兩組均于清晨空腹抽取靜脈血2ml，所有受試者排除近3個(gè)月使用抑制血小板功能藥物史。

1.3 CD41/CD61基因多態(tài)性分析

1.3.1 DNA 的制備

采取的靜脈血標(biāo)本EDTA-Na2抗凝，-40℃保存?zhèn)溆?。根?jù)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第3版)中蛋白酶K法提取全血標(biāo)本DNA，提取試劑盒(離心柱型)購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3.2 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)

1.3.2.1 CD41 PCR 擴(kuò)增 CD41的上游引物5’-CTC AAG GTA AGA GCT GGG TGG AAG AAAGAC-3’，下游引物 5’-CTC ACT ACG AGA ACT GGA TCC TGA AGC CTC-3’。PCR反應(yīng)總體積為10μl，含 200μmol/L dNTP，上、下游引物各 0.3μl和1μl DNA 模板，0.04μlTaqDNA 酶，反應(yīng)條件為 95℃預(yù)變性7min，按下列程序循環(huán)，變性94℃30s，退火58℃30s，引物延伸 72℃15s，共 35 個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7 min。取2μl PCR產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠上電泳，全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.3.2.2 CD61 PCR 擴(kuò)增 CD61的上游引物5’-CTG CAG GAG GTA GAG AGT CGC CAT AG-3’，下游引物5’-CTC TCT AGA CCT CCA CCT TGT GCT CT-3’，PCR 反應(yīng)總體積為 10μl，含 200μmol/L dNTP，上、下游引物各 0.3μl和 1μl DNA 模板，0.04μl TaqDNA 酶，反應(yīng)條件為 95℃ 預(yù)變性 7min，按下列程序循環(huán)，熱變性94℃30s，退火64℃30s，引物延伸72℃15s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7min。取2μl PCR產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠上電泳，全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.3.3 限制性內(nèi)切酶酶切

取CD41 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物4μl用內(nèi)切酶FokⅠ1μl酶切，CD61 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用內(nèi)切酶 ScrFⅠ1μl酶切，37℃水浴6h，反應(yīng)結(jié)束后，各取酶切產(chǎn)物10μl，與1.5μl 6×Loading Buffer(DNA 上樣緩沖液)混合，應(yīng)用含EB 的(終濃度1.0μg/ml)2.0%高分辨率瓊脂糖凝膠電泳，全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.4 CD41/CD61表達(dá)率檢測

采取的靜脈血標(biāo)本6h之內(nèi)進(jìn)行檢測。使用美國Beckman Coulter公司的流式細(xì)胞儀，型號為Epics-XL，每個(gè)樣本分析 10000個(gè)血小板，結(jié)果以CD41/CD61陽性細(xì)胞的百分率表示。所用試劑均由美國Beckman Coulter公司生產(chǎn)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用

應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD41基因多態(tài)性分布分析

限制性內(nèi)切酶FokⅠ將PCR產(chǎn)物切成3種形態(tài):aa(切開型)，ab(部分切開型)，bb(未切開型)。腦梗死組的aa型少于對照組，bb型多于對照組，而兩組的ab型基本相等。腦梗死組bb基因型頻率為41.7%，對照組為23.3%，兩組比較有顯著性差異(P ＜0.05)(見表1)。

2.2 CD61基因多態(tài)性分析

酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析均顯示為基因型aa(未切開型)。腦梗死組 b等位基因頻率為60.4%，對照組為47.6%，兩組比較有顯著性差異(P ＜0.05)(見表2)。

2.3 兩組間CD41/CD61表達(dá)率比較

腦梗死組CD41/CD61表達(dá)率為96.0% ±8%，對照組為85.5% ±13%，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(見表3)。

2.4 兩組間CD41基因多態(tài)性與CD41/CD61表達(dá)率比較

腦梗死組CD41 bb基因型CD41/CD61表達(dá)率較aa基因型增高明顯，差異有顯著性(P＜0.05)(見表4)。

表1 兩組間CD41基因型分布比較

表2 兩組間CD41等位基因比較

表3 兩組間CD41/CD61表達(dá)率比較

表4 兩組間CD41基因多態(tài)性與CD41/CD61表達(dá)率比較

3 討論

腦梗死是嚴(yán)重危害人類身體健康的疾病，動(dòng)脈硬化是其病理學(xué)發(fā)病基礎(chǔ)，尤其是頸部大血管和腦內(nèi)動(dòng)脈存在的粥樣硬化斑塊破裂時(shí)，血管內(nèi)膜損傷激活血小板，血管內(nèi)皮組織和血液中的其他多種成分也同時(shí)被激活。在血小板的參與下，血小板和纖維蛋白原聚集成團(tuán)，不可逆的形成動(dòng)脈血栓，進(jìn)而造成血管栓塞［1，2］。

CD41抗原為整合素的αⅡb鏈，CD61抗原為β2鏈，兩者共同形成CD41/CD61(GPⅡb/Ⅲa)復(fù)合物?，F(xiàn)已證實(shí)，CD41/CD61復(fù)合物是一種雜二聚體整合素，其在胚胎發(fā)生、炎癥、免疫反應(yīng)、腫瘤轉(zhuǎn)移及細(xì)胞聚集等各個(gè)方面起著關(guān)鍵作用。CD41/CD61的分子生物學(xué)研究表明基因定位于17q21～q22，位于血小板表面，每個(gè)血小板表面大約有5 000個(gè)CD41/CD61糖蛋白分子，眾多研究證實(shí)CD41/CD61與纖維蛋白原等的結(jié)合是血小板凝集過程中的最后共同途徑。國外有研究表明CD41基因多態(tài)性與腦梗死發(fā)生有關(guān)［3，4］。國內(nèi)段淏等［5］采用病例對照分析方法，對上海地區(qū)221例入選者進(jìn)行CD41基因多態(tài)性分析，結(jié)果也表明CD41基因多態(tài)性與腦梗死的發(fā)生有相關(guān)性。Wagner等［6］進(jìn)行了 CD61基因多態(tài)性分析，研究表明，年輕女性缺血性腦卒中與CD61的PlA2多態(tài)性無明顯相關(guān)性;馬麗媛［7］、劉彥虹［8］等國內(nèi)學(xué)者也進(jìn)行了CD61基因多態(tài)性的相關(guān)研究，認(rèn)為PlA基因多態(tài)性與腦血栓的發(fā)生無相關(guān)性，他們均認(rèn)為CD61 PlA基因多態(tài)性可能不是中國人缺血性腦卒中重要的危險(xiǎn)因素。本實(shí)驗(yàn)采用病例對照組方法，應(yīng)用PCR-RFLP技術(shù)檢測CD41/CD61基因多態(tài)性，結(jié)果表明CD41的b等位基因頻率腦梗死組較對照組明顯增高;CD61基因型兩組均為aa型(未切開型)。

近年來，隨著識別不同活化血小板膜抗原的單克隆抗體試劑的相繼上市，血栓關(guān)聯(lián)性疾病的血小板膜糖蛋白表達(dá)分析逐漸成為研究熱點(diǎn)，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測血小板活化程度，具有快速、敏感、準(zhǔn)確、特異等諸多優(yōu)點(diǎn)。國外最先研究認(rèn)為，血小板活化時(shí)CD41/CD61復(fù)合物作為纖維蛋白受體可出現(xiàn)變化，表達(dá)率增高［9］，也有人提出檢測相關(guān)表達(dá)率可作為血栓性疾病的預(yù)測指標(biāo)之一［10］，國內(nèi)相關(guān)研究也支持上述觀點(diǎn)［11］。我們采用流式細(xì)胞術(shù)技術(shù)，研究結(jié)果顯示腦梗死組CD41/CD61表達(dá)率較對照組增高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)還將兩組組間按CD41基因型分組檢測CD41/CD61表達(dá)率，結(jié)果腦梗死組CD41 bb基因型CD41/CD61表達(dá)率較 aa基因型明顯增高，差異顯著 (P＜0.05)，研究結(jié)果表明 CD41 bb基因影響 CD41/CD61表達(dá)率。因此對腦梗死患者進(jìn)行CD41基因多態(tài)性分析結(jié)合檢測血小板膜糖蛋白CD41/CD61表達(dá)率，可作為腦梗死的觀察指標(biāo)之一。但是，腦梗死是多基因、多病因疾病，同時(shí)還受到個(gè)體差異等多種因素的影響，綜合研究多種基因多態(tài)性與表達(dá)率在腦梗死疾病發(fā)生發(fā)展中的相互影響及累積效應(yīng)，顯然較個(gè)別基因多態(tài)性與表達(dá)率關(guān)系研究意義更大，這都有賴于今后進(jìn)一步的研究和探索。

［1］Marina K，Alice M，Metallions CI，et al.In vivo platelet activation in ischemic stroke patients［J］.Stroke，2003，34:174-179.

［2］Yip HK，Chen SS，Lin JS，et al.Serial changes in platelet.Activation in patients after ischemic stroke［J］.Stroke，2004，35:1683-1689.

［3］Carlsson LE，Greinacher A，Spitzer C，et al.Polymorphisms of the human platelet antigens HPA-1，HPA-2，HPA-3，and HPA-5 on the platelet receptors for fibrinogen(GPIIb/IIIa)，von Willebrand factor(GPIb/IX)，and collagen(GPIa/IIa)are not correlated with and increased risk for stroke［J］.Stroke，1997，28:1392-1395.

［4］Reiner AP，Kumar PN，Schwartz SM，et al.Genetic variants of platelet glycoprotein receptors and risk of stroke in young women［J］.Stroke，2000，31:1628-1633.

［5］段 淏，孫曉江.血小板糖蛋白Ⅱb基因多肽性與腦梗死的相關(guān)性研究［J］.中國老年學(xué)雜志，2005，25(8):1001-1003.

［6］Wagner KR，Giles WH，Johnson CJ，et al.Platelet glycoprotein receptorⅢa polymorphism P1A2 and ischemic stroke risk:the Stroke Prevention in Young Women Study［J］.Stroke，1998，29(3):581-585.

［7］馬麗媛，趙 勇，王興宇，等.血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa基因Leu33Pro多態(tài)性與缺血性腦卒中的關(guān)系［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2000，16(10):818-819.

［8］劉彥虹，安晶紅，牟鳳云.血小板膜糖蛋白GPⅢa基因多態(tài)性與腦血栓關(guān)系的研究［J］.中國血液流變學(xué)雜志，2007，17(2):185-187.

［9］Cahill MR，Macey MG，Dawson JR，et al.Platelet surface activation antigen expression at baseline and during elective angioplasty in patients with mild to moderate coronary artery disease［J］.Blood Coagul Fibrinolysis，1996，7:165-168.

［10］Gawaz M，Neumann FJ，Ott I，et al.Role of activation dependent platelet membrane glycoproteins in development of subacute occlusive coronary stent thrombosis［J］.Coron Artery Dis，1997，8:121-128.

［11］陸 鋒，張 梅，郭 力.缺血性腦血管疾病患者血小板膜糖蛋白變化及臨床意義［J］.中國實(shí)用內(nèi)科雜志，2006，26:817-819.