趙 靜， 郭鋼花， 臧衛(wèi)東， 張 華， 羅常月， 李倩倩

帕金森病(Parkinson disease，PD)是以黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元丟失為特征的運(yùn)動(dòng)障礙疾病，同時(shí)伴有胃腸功能障礙等非運(yùn)動(dòng)癥狀，主要包括吞咽困難、胃排空障礙和便秘［1］。其機(jī)制尚不明確，可能與胃腸肌間神經(jīng)叢一氧化氮變化有關(guān)。Greene等［2］研究顯示魚藤酮誘導(dǎo)的PD大鼠胃腸傳輸功能受損，但肌間神經(jīng)叢NO能神經(jīng)元沒有變化，Blandini等［3］研究顯示6-OHDA誘導(dǎo)的PD大鼠伴隨著結(jié)腸傳輸減慢，肌間神經(jīng)叢NO能神經(jīng)元是減少的，相反，Chaumette等［4］研究表明MPTP制作的靈長(zhǎng)類PD模型肌間神經(jīng)叢NO能神經(jīng)元是增加的。為探討PD腸神經(jīng)系統(tǒng)一氧化氮的變化，本研究利用6-羥基多巴胺(6-OHDA)損毀大鼠單側(cè)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元制作PD模型，觀察PD大鼠腸神經(jīng)系統(tǒng)NO的改變對(duì)胃腸功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雌性 SD大鼠60只，體重180～220g，鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供。隨機(jī)分為6-OHDA組和對(duì)照組，每組30只。

1.1.2 主要試劑與儀器 6-OHDA、阿樸嗎啡(APO)(美國(guó)Sigma公司);兔抗大鼠一氧化氮合酶(NOS)Ⅰ型多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司);免疫組化SP試劑盒、DAB顯色試劑盒(北京中杉生物工程公司);逆轉(zhuǎn)錄(RT)試劑盒和聚合酶鏈(PCR)試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司);PCR引物由北京賽百盛生物技術(shù)有限公司合成。立體定位儀為江灣Ⅰ型;PCR GeneAmp System(2700)為美國(guó)Applied Biosystems公司產(chǎn)品;電泳儀(DYY-6C)為北京市六一儀器廠產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 大鼠 PD模型制作 10%水合氯醛(400mg/kg)腹腔注射麻醉，固定大鼠于立體定向儀上。以前囟為原點(diǎn)，參照包新民《大鼠腦立體定向圖譜》確定右側(cè)中腦黑質(zhì)定位坐標(biāo)(A:前囟后5.0mm，中線右側(cè)旁2.4mm，硬腦膜下7.6mm;B:前囟后5.6mm，中線右側(cè)旁開1.6mm，硬腦膜下 7.8mm)。鉆開顱骨，向6-OHDA組大鼠的每個(gè)坐標(biāo)點(diǎn)注射6-OHDA 3μl(4μg/μl，溶于含質(zhì)量濃度為 0.02%的維生素 C的生理鹽水中)，以 1μl/min注藥，留針10min，以1mm/min緩慢退針，隨后消毒、縫合皮膚。對(duì)照組用上述方法向每個(gè)坐標(biāo)點(diǎn)注射含0.02%維生素C的生理鹽水3μl。術(shù)后3周，腹腔注射阿樸嗎啡0.5mg/kg誘導(dǎo)大鼠向左側(cè)旋轉(zhuǎn)，記錄30min內(nèi)旋轉(zhuǎn)次數(shù)，大于210r/30min的大鼠為成功模型。

1.2.2 1h糞便排出量 造模后28d將每只大鼠單獨(dú)放在一個(gè)底部鋪有濾紙的干凈的籠子內(nèi)。糞便排出后立即收集在一個(gè)密閉管中，稱重后得到糞便濕重。在65℃下干燥12h，再次稱重得到糞便干重。糞便含水量(%)=(糞便濕重-糞便干重)/糞便濕重×100%。

1.2.3 胃固體食物殘留率測(cè)定 造模后28d，兩組分別取10只大鼠禁食不禁水12h后，大鼠自由進(jìn)食1h移去食物(進(jìn)食前后分別稱重食物)。2h后麻醉處死大鼠，取出胃用濾紙拭干后稱全重，沿胃大彎剪開胃體，洗去胃內(nèi)容物后用濾紙拭干，稱胃凈重，胃內(nèi)殘留率(%)=(胃全重-胃凈重)/食物消耗量×100%。

1.2.4 胃腸nNOS免疫組化檢測(cè) 造模后28d每組取10只大鼠麻醉后經(jīng)4%的多聚甲醛灌流固定，剖腹取大鼠胃竇和近端結(jié)腸組織(距盲腸3cm以下)，石蠟包埋，切片經(jīng)脫蠟、梯度脫水后，3%H2O2室溫孵育15min，微波修復(fù)抗原，10%山羊血清封閉10min，傾去血清，加一抗(兔抗鼠NOSⅠ型多抗)，4℃孵育過夜，TBS洗3次，每次5min，加二抗37℃孵 30min，TBS洗 3次，每次 5min，DAB顯色。蘇木素復(fù)染，脫水、透明，中性膠封片，每組大鼠隨機(jī)選10張相應(yīng)位置的切片。采用Biosens Digital Imaging System v1.6分析軟件計(jì)算胃竇和結(jié)腸nNOS免疫反應(yīng)陽(yáng)性區(qū)平均積分光密度。

1.2.5 胃竇及結(jié)腸平滑肌nNOS mRNA水平檢測(cè) 造模后28d各組取10只大鼠麻醉處死后立即剖腹，常規(guī)Trizol法提取胃竇和近端結(jié)腸組織總RNA，用RT試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA第一鏈片段。PCR擴(kuò)增目的片段，nNO上游引物5’-CACATTTGCATGGGCTCG-3’，下游引物 5’-GACCTGAGATTCCCTTTGTT-3’;β-action 上 游 引 物 5’-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3’下 游 引 物 5’-CCCATACCACCATCACACC-3’。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性 2min，94℃變性 30s，50℃退火 30s，72℃延伸2min，30個(gè)循環(huán)，全部周期結(jié)束后于72℃延伸6min。2%瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)目的條帶。用D-140圖像記錄分析系統(tǒng)對(duì)目的基因條帶的平均灰度值與相應(yīng)的內(nèi)參條帶的平均灰度值的比值進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠1h糞便排出量的比較

見表1。與對(duì)照組比較，6-OHDA組大鼠1h糞便排出量及糞便含水量顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)。

2.2 兩組大鼠胃固體食物殘留率的比較

見表1。與對(duì)照組比較，6-OHDA組大鼠胃內(nèi)固體食物殘留率顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)。

表1 兩組大鼠1h糞便濕重、干重、含水量和胃固體食物殘留率的比較(，n=10)

表1 兩組大鼠1h糞便濕重、干重、含水量和胃固體食物殘留率的比較(，n=10)

與對(duì)照組比較*P＜0.01

組別 糞便濕重(g) 糞便干重(g) 含水量(%) 胃殘留率(%)對(duì)照組6-OHDA組2.329 ±0.287 1.047 ±0.124*1.384 ±0.232 0.812 ±0.093*40.464 ±2.675 22.442 ±1.180*42.297 ±2.581 72.316 ±3.834*

2.3 兩組大鼠胃腸肌間神經(jīng)叢nNOS表達(dá)的比較

nNOS陽(yáng)性產(chǎn)物(主要是nNOS陽(yáng)性神經(jīng)元及神經(jīng)纖維)為棕黃色。6-OHDA組大鼠胃竇部和近端結(jié)腸肌間神經(jīng)叢nNOS陽(yáng)性區(qū)平均積分光密度分別是87.56 ±7.50 和104.11 ±5.22，顯著低于對(duì)照組(132.02 ±11.91，142.82 ±6.32)，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)(見圖1)。

圖1 6-0HDA組胃竇(B)及結(jié)腸(D)肌間神經(jīng)叢nNOS表達(dá)明顯低于對(duì)照組(A、C)(免疫組化染色，×400)

2.4 兩組大鼠胃竇和結(jié)腸平滑肌nNOS mRNA水平的比較

應(yīng)用RT-PCR方法得到的胃腸組織nNOS產(chǎn)物為386 bp，內(nèi)參β-action為207 bp。6-OHDA組大鼠胃竇和近端結(jié)腸組織nNOS mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.746±0.012 和 0.716 ±0.015，明顯低于對(duì)照組(1.563 ±0.031 和 1.489 ±0.030，均 P ＜0.01)(見圖2)。

圖2 胃竇和結(jié)腸nNOS mRNA水平表達(dá)的變化

3 討論

PD患者胃排空延遲主要表現(xiàn)為餐后胃脹氣、早飽、惡心等，Edwards等［1］研究表明24%的PD患者有惡心癥狀，45%有胃脹氣癥狀。Greene等［2］證明了魚藤酮誘導(dǎo)的PD大鼠有明顯的胃排空延遲;而1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)誘導(dǎo)的PD小鼠在不同的時(shí)間點(diǎn)胃固體食物的排空速度沒有改變［5］。本研究表明6-OHDA組大鼠胃排空速度明顯減慢，2h后胃內(nèi)殘留率明顯大于對(duì)照組。

便秘是PD患者最常見的胃腸道癥狀。Jost等［6］發(fā)現(xiàn)所調(diào)查的PD患者中有80%結(jié)腸傳輸時(shí)間延長(zhǎng)。Greene等［2］研究表明，魚藤酮誘導(dǎo)的PD大鼠存在暫時(shí)性的排便頻率減少;而MPTP處理的小鼠結(jié)腸運(yùn)動(dòng)功能亢進(jìn)，排便頻率增加［5］。本研究表明6-OHDA組大鼠在造模后第4周糞便排出量和糞便含水量較對(duì)照組明顯減少。

PD是黑質(zhì)紋狀體多巴胺含量減少，乙酰膽堿系統(tǒng)功能相對(duì)亢進(jìn)引起的運(yùn)動(dòng)障礙疾病，多巴胺和乙酰膽堿也是腸神經(jīng)系統(tǒng)重要的神經(jīng)遞質(zhì)。研究［2，4，5，7］表明 PD 患者和動(dòng)物模型胃腸道膽堿能神經(jīng)元數(shù)目沒有改變，多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目明顯減少。然而根據(jù)多巴胺抑制性的特點(diǎn)，胃腸道多巴胺能神經(jīng)元的減少應(yīng)該是加快而不是減慢胃排空。因此胃腸道非多巴胺能神經(jīng)元在疾病進(jìn)程中也可能受累。PD患者的腸肌叢，特別是NO能神經(jīng)元發(fā)現(xiàn)存在asyn陽(yáng)性包涵物，表明腸道NO能神經(jīng)元受損可能與PD胃輕癱和便秘有關(guān)。Greene等［2］研究表明魚藤酮誘導(dǎo)的PD大鼠胃腸傳輸功能受損，但肌間神經(jīng)叢NO能神經(jīng)元沒有變化。Anderson等［5］研究表明腹腔注射神經(jīng)毒素 MPTP制作的PD小鼠模型，遠(yuǎn)端回腸NO能神經(jīng)元沒有變化，Blandini等［3］通過腦立體定向注射神經(jīng)毒素6-OHDA誘導(dǎo)的大鼠PD模型結(jié)腸傳輸減慢伴隨著肌間神經(jīng)叢NO能神經(jīng)元減少，也有研究［4］表明MPTP制作的靈長(zhǎng)類PD模型肌間神經(jīng)叢NO能神經(jīng)元是增加的。本研究結(jié)果顯示，6-OHDA組大鼠有胃排空延遲和便秘，胃竇和近端結(jié)腸腸肌叢nNOS免疫陽(yáng)性神經(jīng)元顯著減少，nNOS mRNA水平顯著降低。這些研究結(jié)果的差異可能是由于不同的PD動(dòng)物模型NO能系統(tǒng)內(nèi)在不同造成的，或者是由于不同的給藥途徑、給藥劑量造成的。NO作為重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)主要作用是使胃腸道平滑肌發(fā)生松弛反應(yīng)，缺乏可導(dǎo)致胃竇舒張受損和結(jié)腸持續(xù)性痙攣性收縮，引起胃排空延遲和結(jié)腸傳輸減慢。因此臨床上PD患者出現(xiàn)的便秘和胃排空延遲可能是由于NO在胃腸道蠕動(dòng)反射中介導(dǎo)的下行性抑制作用受損造成的。腸道NO能神經(jīng)元受損可能會(huì)引起平滑肌過度收縮，導(dǎo)致肌肉痙攣引起結(jié)腸傳輸減慢，增加腸內(nèi)容物水分的吸收［8］，因此6-OHDA組大鼠糞便含水量較對(duì)照組顯著減少。

本研究結(jié)果表明，6-OHDA誘導(dǎo)的PD大鼠存在胃排空延遲和便秘，可能與腸神經(jīng)系統(tǒng)一氧化氮減少有關(guān)。目前，PD胃腸功能障礙還沒有有效的治療手段。研究PD腸神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)遞質(zhì)的變化、探討胃腸功能障礙的發(fā)生機(jī)制，可以早期進(jìn)行更有效的藥物干預(yù)治療，提高患者的生活質(zhì)量。

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