巴曉紅， 潘鳳英

研究發(fā)現(xiàn)，大鼠持續(xù)吸入純氧氣24h可以誘導(dǎo)明顯的腦缺血耐受稱為OIP［1］，目前在動(dòng)物模型上研究證明腦缺血再灌注后有大量神經(jīng)細(xì)胞凋亡，凋亡是腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)死亡的重要方式［2］。目前已知的凋亡途徑有:死亡受體(death receptor 5，DR)介導(dǎo)的凋亡通路、線粒體/細(xì)胞色素c介導(dǎo)的凋亡通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)途徑。ERS是引起凋亡的重要機(jī)制之一，目前機(jī)制仍未完全闡明。目前OIP對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用在凋亡調(diào)控基因Bcl-2、Bax、原癌基因cfos、星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活、SOD的活性增強(qiáng)等方面已有報(bào)道，但OIP是否對(duì)大鼠局灶腦缺血再灌注模型ERS及其誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡影響的研究未見(jiàn)報(bào)道。CHOP/GADD153是ERS的兩個(gè)經(jīng)典標(biāo)志物之一［3］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察OIP對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后ERS途徑導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡及經(jīng)典標(biāo)志物CHOP/GADD153的表達(dá)，全面動(dòng)態(tài)闡明OIP對(duì)局灶性腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

(1)動(dòng)物:狼褰嗉禨D大鼠180只，雌雄各半，體重250～300g，由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。飼養(yǎng)條件25℃，相對(duì)濕度為60%，光照時(shí)間12h/d，清潔飲水，標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)。(2)儀器和試劑:麻醉氣體分析儀，兔抗大鼠GADDl53免疫組化試劑盒(北京博奧森生物工程公司)，TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒(美國(guó)promega公司)，CIAS-1000型細(xì)胞圖像分析儀，ECL試劑(上海普飛公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 將健康SD大鼠隨機(jī)分為模型組、假手術(shù)組和OIP組。每組按再灌注時(shí)間點(diǎn)(從線栓拔出時(shí)算起)不同再分為3h組、12h組、24h組、48h組、72h組，每組隨機(jī)選12只大鼠，到相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)立即處死。模型組和OIP組大鼠均用線栓法造成右側(cè)MCAO模型，2h后開(kāi)放灌注。OIP組大鼠于術(shù)前置于OIP密閉吸氧箱內(nèi)，內(nèi)置鈉石灰吸收二氧化碳，輸入100%醫(yī)用氧氣，用麻醉氣體分析儀監(jiān)測(cè)氧氣濃度達(dá)100%開(kāi)始計(jì)時(shí)，持續(xù)吸氧24h，間隔24h后造模(方法同模型組)。

1.2.2 動(dòng)物模型的制備 線栓法［4］制作大腦右側(cè) MCAO 模型［5，6］，缺血2h 后將栓線拔出使其血流恢復(fù)，假手術(shù)組將栓線插入后隨即拔出。

1.2.3 腦片制作及組織保存 OIP組將動(dòng)物持續(xù)吸100%氧24 h，間隔24 h后行大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型，造模成功并于再灌注后3h、12h、24h、48h、72h時(shí)間點(diǎn)每組隨機(jī)取6只大鼠用4%多聚甲醛局部灌注內(nèi)固定，斷頭取腦，自額區(qū)至枕區(qū)分為A、B、C、D、E五等分，取C腦片常規(guī)酒精脫水，石蠟包埋制成5μm厚防脫切片，分別行tunel檢測(cè)、GADD153免疫組化染色。另外，每組隨機(jī)取6只大鼠于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)麻醉后立即處死，在冰臺(tái)上迅速分離出海馬組織立刻置于液氮中保存，以備行Western-Blot檢測(cè)。

1.2.4 神經(jīng)功能評(píng)分 參照文獻(xiàn)［7］對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，0分:無(wú)明顯神經(jīng)功能缺損表現(xiàn);1分:不能伸展左側(cè)前肢;2分:行走時(shí)向左側(cè)旋轉(zhuǎn);3分:行走時(shí)向左側(cè)傾斜;4分:行走時(shí)向左側(cè)傾倒，意識(shí)喪失。

1.2.5 Tunel染色 采用TUNEL法原位標(biāo)記DNA片斷，檢測(cè)凋亡細(xì)胞，試劑盒由美國(guó)promega公司提供，嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行操作。每例大鼠隨機(jī)選取6張相同部位切片，在缺血再灌注側(cè)海馬CA1區(qū)隨機(jī)選取6個(gè)不重疊高倍鏡視野(×200)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞 (胞核含棕黃色顆粒)率［(陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù))×100%］。

1.2.6 免疫組化染色 GADD153免疫組化染色試劑盒購(gòu)于北京博奧森生物工程公司，采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)法(SP法)免疫組化染色檢測(cè)GADD153，切片常規(guī)脫蠟水化后放入新鮮配制的3%H2O2溶液中室溫下孵育10min，微波抗原修復(fù)后，滴加羊血清封閉液15min，滴加兔抗GADD153抗體室溫孵育15min，于4℃過(guò)夜，滴加生物素化羊抗鼠IgG 15min，辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液室溫下孵育15min，以上各步驟除了滴加羊血清封閉液一步外均用PBS洗3min×3次，最后用DAB顯色。每例大鼠隨機(jī)選取6張相同部位切片，在缺血再灌注側(cè)海馬CA1區(qū)隨機(jī)選取6個(gè)不重疊高倍鏡視野(×200)，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(胞核含棕黃色顆粒)。

1.2.5 Western-Blot檢測(cè) 采用胞核-胞漿蛋白裂解液裂解蛋白，BCA法蛋白定量(PIERCE公司)。上樣后SDS-PAGE凝膠電泳;濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)PVDF膜;一抗(1∶200)4℃孵育過(guò)夜后二抗孵育;ECL試劑(上海普飛公司)發(fā)光顯影成像;光片于凝膠成像系統(tǒng)白光下掃描，進(jìn)行吸光度分析，用同一標(biāo)本內(nèi)參進(jìn)行校正，并按公式相對(duì)值=目的條帶表達(dá)強(qiáng)度/tubulin表達(dá)強(qiáng)度計(jì)算出相對(duì)值。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用spss13.6軟件統(tǒng)計(jì)分析，檢測(cè)數(shù)據(jù)用表示，多組間比較采用析因設(shè)計(jì)的方差分析法，組間和組內(nèi)差異性比較在方差齊性檢驗(yàn)后，采用單因素方差分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OIP對(duì)大鼠局灶腦缺血再灌注后的神經(jīng)功能評(píng)分比

大鼠麻醉清醒后神經(jīng)功能缺損癥狀和體征:假手術(shù)組大鼠自由活動(dòng)、進(jìn)食，無(wú)明顯的癥狀和體征;模型組大鼠活動(dòng)和進(jìn)食均減少、出現(xiàn)右側(cè)Horner征、精神萎靡，左上肢癱瘓，肌力減退，行走時(shí)向左側(cè)偏斜或旋轉(zhuǎn)，有的跌倒或完全癱瘓，大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分:假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)大鼠分別為3.00±0.48、3.01 ±0.44、2.99 ±0.50、3.01 ±0.42、3.02 ±0.41，差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。模型組與假手術(shù)組比較，差異顯著(P＜0.05)，評(píng)分明顯增加，24h時(shí)間點(diǎn)與組內(nèi)其它時(shí)間點(diǎn)比較，差異顯著(P＜0.05)，評(píng)分顯著增加。OIP組與模型組比較，差異顯著(P＜0.05)，評(píng)分明顯減少(見(jiàn)表1)。

2.2 Tunel法檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果

假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)偶見(jiàn)凋亡細(xì)胞，組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)比較，差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。模型組與假手術(shù)組比較，差異顯著(P＜0.05)，再灌注3h偶見(jiàn)少量凋亡細(xì)胞(4.17% ±1.11%)，12h后凋亡細(xì)胞開(kāi)始明顯增多(24.54% ±3.10%);至 24h，凋亡細(xì)胞數(shù)量達(dá)高峰(51.90% ±8.29%)，細(xì)胞核濃縮，呈棕色或棕褐色，核形不規(guī)則，致密，形狀不規(guī)則;再灌注48h凋亡細(xì)胞減少(36.93% ±5.63%)，至72h凋亡細(xì)胞明顯減少(15.04% ±2.29%)。24h時(shí)凋亡率最高，與組內(nèi)其它時(shí)間點(diǎn)比較，差異顯著(P＜0.05)。OIP組凋亡率與模型組比較，差異顯著(P＜0.05)，各時(shí)間點(diǎn)較模型組均減少(見(jiàn)圖1、表2)。

2.3 GADD153免疫組化結(jié)果

假手術(shù)組大鼠各時(shí)間點(diǎn)GADD153極少見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞平均灰度值為 144.67±7.30、145.00 ± 18.49、143.82 ± 13.54、146.96 ± 6.35、143.78±10.58，各時(shí)間點(diǎn)比較，差異無(wú)顯著性(P ＞0.05)。模型組與假手術(shù)組比較，差異顯著(P＜0.05)，缺血再灌注3h，可見(jiàn)少量陽(yáng)性細(xì)胞，陽(yáng)性表達(dá)主要位于細(xì)胞核，核呈棕黃色，胞漿可有黃染，平均灰度值為126.60±5.65，再灌注12h陽(yáng)性細(xì)胞開(kāi)始增多，平均灰度值為111.41 ±14.44，至 24h，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量達(dá)高峰，平均灰度值為97.75±16.12，48h陽(yáng)性細(xì)胞開(kāi)始減少(112.40±10.25)，至再灌注72h陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少(124.94±9.66)，再灌注24h與組內(nèi)其它時(shí)間點(diǎn)比較，差異顯著(P＜0.05)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量最多。OIP組與模型組比較，差異顯著(P＜0.05)，OIP組陽(yáng)性表達(dá)明顯減少(見(jiàn)圖2、表3)。

2.4 Western-blot檢測(cè)結(jié)果

Western-blot檢測(cè)示 GADD153目的條帶為29Kda。各組3h時(shí)間點(diǎn)和假手術(shù)組 GADD153均未見(jiàn)明顯蛋白條帶，模型組于再灌注12h后可見(jiàn)少量表達(dá)，至再灌注24h達(dá)高峰，48h之后逐漸下降，72h僅有少量表達(dá)。12h，24h，48h，72h時(shí)間點(diǎn) OIP組與模型組比較，差異顯著(P＜0.05)，表達(dá)大幅度減少(見(jiàn)圖3、表4)。

表1 OIP對(duì)局灶腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分的影響(，n=6)

表1 OIP對(duì)局灶腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分的影響(，n=6)

與模型組比較△P＜0.05;與假手術(shù)組比較▽P＜0.05;與組間不同時(shí)間點(diǎn)比較※P＜0.05

組別3h 12h 24h 48h 72h假手術(shù)組模型組OIP組3.00 ±0.48 4.66 ±0.26▽3.50 ±0.30△3.01 ±0.44 5.01 ±0.29▽4.02 ±0.29△2.99 ±0.50 5.55 ±0.24▽※4.49 ±0.30△3.01 ±0.42 5.02 ±0.27▽4.09 ±0.27△3.02 ±0.41 4.78 ±0.26▽3.60 ±0.28△

表2 各組各時(shí)間點(diǎn)右側(cè)海馬CA1區(qū)細(xì)胞凋亡率(%)(，n=6)

表2 各組各時(shí)間點(diǎn)右側(cè)海馬CA1區(qū)細(xì)胞凋亡率(%)(，n=6)

與模型組比較△P＜0.05;與假手術(shù)組比較▽P＜0.05;與組間不同時(shí)間點(diǎn)比較※P＜0.05

組別3h 12h 24h 48h 72h假手術(shù)組模型組OIP組1.01 ±0.01 4.17 ±1.11▽1.05 ±0.02△0.90 ±0.09 24.54 ±3.10▽12.30 ±2.13△1.00 ±0.02 51.90 ±8.29▽※17.56 ±2.60△1.01 ±0.02 36.93 ±5.63▽10.28 ±2.47△1.01 ±0.01 15.04 ±2.29▽3.42 ±0.69△

表3 各組大鼠海馬右側(cè)CA1區(qū)GADD153表達(dá)平均灰度值(，n=6)

表3 各組大鼠海馬右側(cè)CA1區(qū)GADD153表達(dá)平均灰度值(，n=6)

與模型組比較△P＜0.05;與假手術(shù)組比較▽P＜0.05;與組間不同時(shí)間點(diǎn)比較※P＜0.05

組別3h 12h 24h 48h 72h假手組模型組OIP組144.67 ±7.30 126.60 ±5.65▽136.28 ±16.44△145.00 ±18.49 111.41 ±14.44▽130.05 ±9.31△143.82 ±13.54 97.75 ±16.12▽※112.07 ±6.53△146.96 ±6.35 112.40 ±10.25▽125.73 ±11.93△143.78 ±10.58 124.94 ±9.6▽135.30 ±9.18△

表4 各組大鼠缺血側(cè)海馬CA1區(qū)GADD153表達(dá)相對(duì)值(，n=6)

表4 各組大鼠缺血側(cè)海馬CA1區(qū)GADD153表達(dá)相對(duì)值(，n=6)

與模型組比較△P＜0.05;與假手術(shù)組比較▽P＜0.05;與組間不同時(shí)間點(diǎn)比較※P＜0.05

組別3h 12h 24h 48h 72h假手術(shù)組模型組OIP組000 0 0.1776 ±0.04▽0.071 ±0.01△0 0.6081 ±0.05▽※0.2432 ±0.01△0 0.5179 ±0.03▽0.2072 ±0.01△0 0.3563 ±0.04▽0.1425 ±0.01△

圖1 Tunel法檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果

圖2 GADD153免疫組化結(jié)果

圖3 GADD153(29KD)Western-blot條帶

3 討論

巴曉紅［8］、張西京［9］等實(shí)驗(yàn)顯示，OIP 后腦缺血再灌注模型得以增強(qiáng)超氧化物岐化酶的活性，清除氧自由基，誘導(dǎo)凋亡相關(guān)基因 Bax、Bcl-2表達(dá)，但OIP對(duì)大鼠腦缺血再灌注模型過(guò)度ERS中未折疊蛋白反應(yīng)及其誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。

腦缺血再灌注后存在鈣穩(wěn)態(tài)失衡和過(guò)氧化損傷，由此可引起ERS，激活未折疊蛋白反應(yīng)(unfoldprotein response，UPR)，使蛋白折疊能力提高、蛋白合成抑制以適應(yīng)應(yīng)激，但是長(zhǎng)時(shí)間過(guò)強(qiáng)的ERS則啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)中模型組GADDl53表達(dá)上調(diào)表明缺血再灌注啟動(dòng)了ERS，激活UPR，使蛋白折疊能力提高、蛋白合成抑制以適應(yīng)應(yīng)激，GADD153是ERS的經(jīng)典標(biāo)志物［10］，GADD153在正常情況下位于胞漿，表達(dá)水平極低;然而在應(yīng)激情況下可移位至胞核，表達(dá)顯著增加。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)模型組與假手術(shù)組比較，GADD153免疫組化結(jié)果陽(yáng)性細(xì)胞平均灰度值和 Western-blot檢測(cè)結(jié)果GADD153蛋白含量相對(duì)值及細(xì)胞凋亡率均明顯增加(P＜0.05)，GADD153在 24h時(shí)表達(dá)最高，凋亡在24h達(dá)到高峰，且GADD153上調(diào)與神經(jīng)細(xì)胞凋亡保持一致。

現(xiàn)己知，哺乳動(dòng)物的UPR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)形成了3條相互聯(lián)系的通路:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)膜蛋白激酶通路:(ER transmembrane protein kinase，IREI);雙鏈 RNA 激活蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(double-stranded RNA-activatedprotein kinase-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)通路和活化轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6，ATF6)通路。ERS時(shí)，UPR反應(yīng)通過(guò)下調(diào)翻譯和上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶分子等減少ERS，達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的目的;但持續(xù)或過(guò)強(qiáng)的UPR效應(yīng)可誘導(dǎo)原本與IREI、PERK、ATF6緊密結(jié)合的 GRP78與之解離，進(jìn)而激活GADD153和caspase-12等的活性，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。3條通路的之間的聯(lián)系:通路之間的功能重疊現(xiàn)象:雖然IRE1，PERK和ATF6的激活是各自獨(dú)立的，但是在UPR的過(guò)程中卻存在廣泛的交流。這3條信號(hào)通路都可以誘導(dǎo)GADD153轉(zhuǎn)錄，但是這其中 PERK 通路最重要［11，12］。GADD153 是一個(gè)由抗凋亡向促凋亡轉(zhuǎn)換的重要信號(hào)分子，可以抑制BCL-2并可以使線粒體對(duì)BH3-only蛋白敏感，使細(xì)胞谷胱甘肽耗竭引起細(xì)胞凋亡。過(guò)表達(dá)GADD153可以導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯并最終使細(xì)胞凋亡，但對(duì)其下游認(rèn)識(shí)還十分有限［13］。GADD153是一個(gè)b-ZIP轉(zhuǎn)錄因子，屬于CCAATP增強(qiáng)子連接蛋的轉(zhuǎn)錄因子C/EBP家族.正常情況下它表達(dá)非常低:在ERS時(shí)，通過(guò)以下機(jī)制上調(diào)表達(dá):(1)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白 IREI和 ATF6活化［14］。其胞漿活性部分(XBP1和ATF6)進(jìn)入核內(nèi)，與ERS反應(yīng)元件序列中的CCAAT N9-CCACG中的CACG相連，在NF-Y的協(xié)同作用下，啟動(dòng)GADD153轉(zhuǎn)錄與表達(dá);(2)通過(guò)PERK-6172a途徑活化，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子ATF4和ATF3表達(dá)，前者結(jié)合氨基酸調(diào)控元件，再誘導(dǎo)GADD153表達(dá)。GADD153可能通過(guò)下調(diào)Bcl-2表達(dá)、耗竭谷胱甘肽、促進(jìn)活性氧族產(chǎn)生等，活化caspase-3，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［15］。GADD153基因敲除可增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)抗ERS所致凋亡的能力;與此相反，GADD153過(guò)度表達(dá)的細(xì)胞則對(duì)ERS所致凋亡更為敏感。

我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在腦缺血再灌注術(shù)前24 h，給予大鼠吸入100%純氧24h，各時(shí)間點(diǎn)可以發(fā)現(xiàn)模型組與假手術(shù)組比較，GADD153陽(yáng)性細(xì)胞灰度值、蛋白含量相對(duì)值和凋亡細(xì)胞率均明顯增加(P＜0.05)，OIP組較模型組均減少(P ＜ 0.05)。GADD153陽(yáng)性細(xì)胞灰度值、蛋白含量相對(duì)值和Tunel檢測(cè)凋亡細(xì)胞率結(jié)果在24h時(shí)表達(dá)最高，證實(shí)GADD153上調(diào)與神經(jīng)細(xì)胞凋亡一致。OIP可以抑制GADD153上調(diào)，證實(shí)OIP對(duì)大鼠局灶腦缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是:(1)直接對(duì)抗缺血神經(jīng)元缺氧及自由基的產(chǎn)生，減輕ERS。(2)可降低PERK通路相關(guān)基因GADD153及GADD34在缺血半暗帶的表達(dá)，從而抑制缺血再灌注誘發(fā)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，發(fā)揮減輕神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用減輕了經(jīng)由GADD153途徑誘導(dǎo)的凋亡。(3)通過(guò)抑制某些促凋亡基因(如 caspase-3、c-fos、c-Jun、p53)和/或促進(jìn)某些抑凋亡基因(如Bcl-2、HSP70)等的表達(dá)，抑制GADD153的表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)OIP對(duì)大鼠局灶腦缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，從而為治療缺血性腦血管疾病提供一個(gè)重要的新思路。

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