李 俊， 趙天春， 段 萍， 韓雪飛， 梁 晨， 邢 瑩

β-淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)的神經(jīng)毒性是引起阿爾茨海默病(AD)神經(jīng)元變性的重要因素，Aβ25-35是Aβ蛋白的主要的活性片段。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)可以分化為神經(jīng)細(xì)胞，應(yīng)用于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病。在AD患者腦中的Aβ濃度高于正常，可以引起AD的另一個重要病理改變相關(guān)蛋白Tau磷酸化水平升高。Tau蛋白是微管的主要組成之一，Tau蛋白過度磷酸化會影響神經(jīng)細(xì)胞胞體與軸突營養(yǎng)輸送和細(xì)胞骨架的穩(wěn)定。MSCs移植進(jìn)入AD患者腦內(nèi)，高濃度Aβ對其會有什么影響呢?我們的研究通過體外實驗在高濃度Aβ環(huán)境中，誘導(dǎo)MSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞，觀察體外誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)和骨架蛋白Tau的磷酸化的變化。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 DMEM、胎牛血清(FBS)均購自Thermo公司。兔抗NSE抗體、GFAP抗體、PA免疫組化試劑盒為中杉金橋公司出品;鼠抗Tau抗體為USBiologieal公司產(chǎn)品;EGF和bFGF均為sigma公司產(chǎn)品。其余試劑均為國產(chǎn)分析純級試劑。

1.2 動物 雄性SD大鼠，體重100g左右，普通級，由鄭州大學(xué)實驗動物中心提供。

1.3 MSCs的體外分離培養(yǎng) SD大鼠斷頸處死，放入75%酒精內(nèi)浸泡5min。在無菌條件下，取出脛骨和股骨，滅菌的PBS緩沖液沖洗;剪斷骨骺端，暴露骨髓腔，用加入10%FBS的L-DMEM培養(yǎng)液反復(fù)沖洗骨髓腔，得到的沖洗培養(yǎng)液吹打后，以1×106/ml接種到培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3d后首次換液，7d傳代。以后每3～4d傳代，第3代后細(xì)胞純化后用于實驗。

1.4 體外誘導(dǎo)MSCS向神經(jīng)細(xì)胞分化及Aβ的干預(yù) 將細(xì)胞分為兩組，對照組:不加Aβ，細(xì)胞達(dá)80%～90%融合時開始進(jìn)行誘導(dǎo)分化，加入預(yù)誘導(dǎo)液DMEM培養(yǎng)基/體積分?jǐn)?shù)為10%的FCS/10μg/L堿性成纖維生長因子(bFGF)培養(yǎng)24h，而后換為誘導(dǎo)液DMEM培養(yǎng)基/體積分?jǐn)?shù)為2%(DMSO)二甲基亞砜/200μmol/L丁羥茴醚(BHA)誘導(dǎo)5h。誘導(dǎo)過程中在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。實驗組:誘導(dǎo)分化前24h，在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入Aβ(終濃度20μmol/L)，其它同對照組。

1.5 Western blotting檢測 棄去培養(yǎng)基，在培養(yǎng)瓶中加入胰酶消化，使細(xì)胞脫落，離心去上清，PBS洗去殘留胰酶，將細(xì)胞移入0.5ml EP管，再加入100 μl細(xì)胞裂解液。震蕩混勻，冰盒靜置20min。放入低溫離心機(jī)，4℃、12000r/min、10min，取出將上清移入另一新的干凈0.5ml EP管，加入1/4體積5×蛋白加樣緩沖液，混勻，沸水浴5min。取部分蛋白樣品用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測定。根據(jù)測定的蛋白濃度，用1×蛋白加樣緩沖液將各樣本濃度調(diào)至一致。10%SDS-PAGE凝膠電泳(濃縮膠:恒壓100V約20～30min，分離膠:恒壓150V約 50～60min)，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜(恒壓150V 60～80min)，室溫封閉1h，用封閉液稀釋一抗，4℃孵育過夜，IgG二抗(1∶5000稀釋)，37℃孵育2h。ECL發(fā)光顯色，X光底片曝光。以β-actin為內(nèi)參照，實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)觀察及鑒定 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化神經(jīng)樣細(xì)胞前后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，有梭形分化為伸出突起的神經(jīng)樣形態(tài)(見圖1、圖2)。誘導(dǎo)后的實驗組細(xì)胞突起明顯短于對照組，且細(xì)胞折光性較差(見圖3)。免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定誘導(dǎo)后細(xì)胞表達(dá)NSE，即誘導(dǎo)后的細(xì)胞為神經(jīng)細(xì)胞(見圖4)。

2.2 Western blot Aβ實驗組的誘導(dǎo)后神經(jīng)細(xì)胞GSK-3β表達(dá)明顯高于對照組細(xì)胞表達(dá)水平(見圖5)，Aβ 實驗組 Tau［pSer262］蛋白和 Tau［pSer396］蛋白表達(dá)高于對照組誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞(見圖 6、圖 7)

圖1 誘導(dǎo)前骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(40×)

圖2 對照組誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞(40×)

圖3 Aβ處理組誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞(40×)

圖4 BMSC誘導(dǎo)后神經(jīng)細(xì)胞的NSE染色(40×)

圖5 GSK-3β表達(dá)

圖6 Tau［pSer262］蛋白表達(dá)

圖7 Tau［pSer396］蛋白

3 討論

Alzheimer病(AD)是近期記憶和智力功能進(jìn)行性惡化為臨床特點的一種神經(jīng)系統(tǒng)常見疾病。AD大腦的特征性病理改變包括胞外Aβ沉積形成的老年斑和細(xì)胞內(nèi)Tau蛋白異常磷酸化形成的神經(jīng)元纖維纏結(jié)并伴隨神經(jīng)元的大量喪失［1］。因此，如果能補(bǔ)充AD大腦丟失的神經(jīng)元，可以為AD的治療找到一條新的途徑。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有分化為神經(jīng)元細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞的能力，能提供大量腦組織細(xì)胞的細(xì)胞。它可以作為細(xì)胞供體，對于治療一些神經(jīng)退行性疾病，具有重要的臨床意義。

大量的實驗結(jié)果和臨床資料表明，Aβ是各種原因誘發(fā)AD的共同通路，是AD形成和發(fā)展的關(guān)鍵因素［2］。淀粉瀑布樣反應(yīng)假說認(rèn)為AD患者腦中由于Aβ的沉積導(dǎo)致Tau蛋白被異常磷酸化，從而降低了微管組裝能力，導(dǎo)致神經(jīng)功能喪失。目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為Aβ是AD發(fā)病的始動因素，而Tau蛋白過度磷酸化可能是AD最重要的分子病理變化之一，是其發(fā)病機(jī)制中的一個核心環(huán)節(jié)［3］。

凝聚態(tài)Aβ25-35通過GSK-3β、MAPK等激酶可使正常的神經(jīng)細(xì)胞 Tau蛋白異常磷酸化增多［4，5］。Tau蛋白有21個磷酸化位點，其中只有少數(shù)位點參與調(diào)節(jié)Tau蛋白的微管結(jié)合活性［6］。Tau蛋白在ser396、ser262位點的異常磷酸化具有一定的代表性。Hardy和Higgins認(rèn)為Aβ可直接引起Tau蛋白過度磷酸化和NFTs的形成，最終導(dǎo)致神經(jīng)元退行性改變［7］。Sigurdsson等將凝聚態(tài) Aβ25-35注射至Fischer大鼠單側(cè)杏仁核，觀察到腦內(nèi)杏仁核和海馬神經(jīng)元Tau蛋白異常磷酸化8d后增多，32d達(dá)到高峰，此后逐漸減弱，持續(xù)至128d。本實驗結(jié)果顯示Aβ可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)的神經(jīng)樣細(xì)胞的Tau蛋白磷酸化水平升高，這與在神經(jīng)組織的變化相同。

在Aβ的環(huán)境中骨髓干細(xì)胞可以分化為神經(jīng)細(xì)胞，但細(xì)胞的突觸明顯比正常分化組細(xì)胞突觸短。已有研究表明，在Tau缺陷的小鼠胚胎海馬細(xì)胞培養(yǎng)與對照Tau蛋白正常表達(dá)的細(xì)胞對比，觀察到缺陷小鼠細(xì)胞的軸突延伸延遲。說明Tau有促進(jìn)軸突的生長的調(diào)節(jié)作用［8］。本實驗發(fā)現(xiàn)Tau磷酸化水平升高，Tau蛋白促進(jìn)軸突的延伸的作用減弱。另外Tau磷酸化后影響其與微管的結(jié)合，而不能起到穩(wěn)定微管的作用［9］，導(dǎo)致微管系統(tǒng)功能受損，進(jìn)一步影響到軸漿運輸，同樣影響到軸突的延伸。

本研究表明，在Aβ的環(huán)境中，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞受到明顯影響，且嚴(yán)重影響細(xì)胞功能，故在AD患者采用骨髓干細(xì)胞移植時，應(yīng)該采取相應(yīng)措施以減少Tau異常磷酸化，例如移植細(xì)胞部位注入 GSK-3β抑制劑以減少 Tau蛋白磷酸化［10］。

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