吳曉冬， 王麗娜， 薄立華， 劉 勇， 朱 輝

腦血管病是嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一，其死亡人數(shù)也呈逐年上升的趨勢。缺血性腦梗死的病理過程涉及復(fù)雜的時間和空間級聯(lián)反應(yīng)，雖然對其機(jī)制的了解越來越深入，但有效的治療手段仍然缺乏，仍然迫切需要研究新的治療方法。

十幾年研究表明，腦缺血時，除神經(jīng)元壞死外，還有另外一種細(xì)胞死亡的形式-細(xì)胞凋亡，在腦缺血損傷的病理過程中起重要作用。近年來減少腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)元的凋亡一直是治療腦缺血的熱門課題。Caspase是一類半胱氨酸特異性的蛋白酶［1］，其對神經(jīng)元的凋亡發(fā)生起關(guān)鍵作用。而ZVAD-fmk是非競爭性的 caspase抑制劑［2］，為此，我們用延遲注射Z-VAD-fmk治療大鼠局灶性腦缺血，通過TUNEL染色和ED-1表達(dá)檢測探討其對腦缺血的凋亡和炎癥的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組 健康雄性Wistar大鼠，體重280 ～320g 共60 只，參照 Koizumi［3］和 Longa［4］發(fā)明的腔內(nèi)線栓法制備大鼠大腦中動脈局灶性腦梗死動物模型(MCAo)，1h后拔出尼龍線，使之再通。隨機(jī)分為Z-VAD-fmk治療組、生理鹽水對照組，每組動物30只。

1.2 主要試劑 Z-VAD(MBL);ED-1單克隆抗體(Serotec);TUNEL試劑盒(Promega)。

1.3 方法

1.3.1 給藥方法 在MCAo大鼠腦血流再通半個小時后固定于立體定位儀上，以1μl/min速度側(cè)腦室內(nèi)泵入 Z-VAD-fmk 70μg/kg(4μl)，緩慢將針退出。對照組用相同體積的生理鹽水，注射一次。

1.3.2 分別在MCAo術(shù)后第1天、第4天、第7天各處死20只大鼠。用水合氯醛腹腔注射，呼吸降至1～2次/分時暴露心臟，用套管針穿刺左心室，拔出針芯后，將管頭置于升主動脈開口處，剪開右心耳，注入冰PBS，待肝臟變白后，灌注4%福爾馬林PBS固定液。-20℃放置1h后用咬骨鉗咬開顱骨，取出腦標(biāo)本。選擇視交叉水平的腦組織切片，進(jìn)行HE染色及TUNEL和ED-1免疫組化染色。

1.3.3 腦組織凋亡細(xì)胞的原位檢測(TUNEL法) 按試劑盒說明書進(jìn)行，鏡下(×400)計數(shù)病變側(cè)大腦皮質(zhì)5個視野中染色陽性細(xì)胞數(shù)目，取其均值。

1.3.4 ED-1免疫組化染色 按試劑盒說明，第一抗體4℃過夜，生物素標(biāo)記的第二抗體，室溫孵育30min。新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察3～10min，用PBS沖洗，使反應(yīng)停止。

1.3.5 陽性細(xì)胞計數(shù) 每組選10例標(biāo)本，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)計算，實(shí)驗(yàn)組與對照組的梗死程度沒有統(tǒng)計學(xué)意義。每例標(biāo)本在梗死區(qū)域的中軸線上，均勻的選取5個高倍視野，計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，5個區(qū)域陽性細(xì)胞數(shù)的平均值做為一個標(biāo)本的數(shù)據(jù)。最后進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)計算量化結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 ED-1免疫組化染色結(jié)果 ED-1蛋白是細(xì)胞漿中的一種非分泌性蛋白，是巨噬細(xì)胞和活化的小膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志，結(jié)果顯示在MCAo后第4天和第7天對照組與用藥組之間差異非常顯著(見表 1、圖1)。

2.2 TUNEL染色結(jié)果 TUNEL染色陽性細(xì)胞在MCAo術(shù)后第1天即有實(shí)驗(yàn)組和對照組間的陽性細(xì)胞數(shù)的顯著差異，第4天和第7天也同樣有統(tǒng)計學(xué)差異(P ＜0.05)(見表2、圖2)。

表1 ED-1陽性細(xì)胞計數(shù)結(jié)果

表2 TUNEL陽性細(xì)胞計數(shù)結(jié)果

3 討論

腦缺血后再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，與自由基的生成、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、興奮性氨基酸毒性、線粒體功能障礙、炎癥反應(yīng)、凋亡等一系列因素有關(guān)［5］。急性局灶性腦缺血引起的缺血中心區(qū)死亡以細(xì)胞壞死為主，目前認(rèn)識的比較清楚，而腦缺血半暗帶圍繞在壞死區(qū)周圍，是潛在的可挽救的結(jié)構(gòu)完整腦區(qū)［5］。近年來認(rèn)識到半暗帶區(qū)域于再灌注數(shù)天后出現(xiàn)了遲發(fā)性神經(jīng)元死亡，主要發(fā)生在海馬、紋狀體及皮質(zhì)區(qū)域。而細(xì)胞凋亡是神經(jīng)元遲發(fā)性死亡的主要形式，因此，神經(jīng)細(xì)胞凋亡是神經(jīng)細(xì)胞喪失及神經(jīng)功能損害的重要原因之一。

為此，人們力求尋找能抑制半暗帶細(xì)胞凋亡的方法來治療腦缺血，以抑制或減少遲發(fā)性神經(jīng)元凋亡的發(fā)生，挽救半暗帶內(nèi)神經(jīng)元。已經(jīng)明確凋亡存在著3條細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑，分別是死亡受體途徑、線粒體途徑及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑。最經(jīng)典的是細(xì)胞內(nèi)外各種死亡信號可誘導(dǎo)線粒體釋放Cyto-c，Cyto-c再與Apaf-1結(jié)合，使 Apaf-1發(fā)生構(gòu)象改變。再與 procaspase-9結(jié)合，形成 Cyto-c Apaf-1 procaspase-9即“凋亡小體”(apoptosome)，從而使procaspase-9活化并激活下游其他 caspase［6～8］。但無論哪一條途徑都有 caspase的密切參與，完成凋亡過程。而 ZVAD-fmk(N-benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethyl ketone)是一種非選擇性的不可逆性的細(xì)胞通透性肽類caspases抑制劑，通過與caspases氟甲烷酮(FMK)基團(tuán)發(fā)生不可逆結(jié)合而發(fā)揮作用。ZVAD-fmk作用廣泛，是廣譜caspases抑制劑。應(yīng)用Z-VAD-fmk可阻斷細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞存活率。2000年Huang等［9］首次發(fā)現(xiàn)，在缺血發(fā)作后應(yīng)用ZVAD-fmk可以有效縮小缺血/再灌注損傷所造成的大鼠心肌梗死范圍。我們選擇延遲注射caspase抑制劑Z-VAD-fmk治療大鼠局灶性腦缺血，使之更符合臨床，觀察其對凋亡和炎癥的影響。

首先對病理標(biāo)本進(jìn)行了TUNEL染色，結(jié)果顯示在MCAo術(shù)后第1天即開始有凋亡陽性細(xì)胞的減少，而且在用藥組和對照組之間有顯著差異，說明在腦缺血的急性期，Z-VAD-fmk已開始發(fā)揮作用，而且貫穿腦缺血從第1天到第7天都有效果，皆顯示用藥組和對照組的明顯差異。

炎性反應(yīng)是腦梗死的一個重要病理變化過程，它在腦梗死中的作用逐漸被學(xué)者所重視，那么，Z-VAD-fmk抑制了caspase，即抑制了凋亡的發(fā)生外，對炎癥是否有影響呢?因?yàn)榕c腦缺血炎癥反應(yīng)關(guān)系密切的炎癥細(xì)胞主要有白細(xì)胞與單核-巨噬細(xì)胞［10］。在腦梗死的早期(1d以內(nèi))中性粒細(xì)胞就開始浸潤，持續(xù)3d左右，即消失;從梗死后3d開始，巨噬細(xì)胞大量出現(xiàn)在損傷區(qū)域，一直持續(xù)到梗死后3w或更長。它的作用開始被認(rèn)為主要是清理損傷區(qū)域，幫助損傷區(qū)域盡快恢復(fù)，近年來，隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)過高水平的炎性反應(yīng)會加重腦損傷，擴(kuò)大損傷面積，只有適度的炎性反應(yīng)對于腦損傷才是有益的，通常腦梗死的炎性反應(yīng)水平都是過高的，是對腦組織不利的。許多學(xué)者證實(shí)在腦梗死后降低炎性反應(yīng)水平，抑制巨噬細(xì)胞浸潤，可減少梗死面積。為此，我們采用ED-1抗體對標(biāo)本進(jìn)行了免疫組織化學(xué)染色。ED-1是細(xì)胞漿中的一種非分泌性蛋白，是巨噬細(xì)胞和活化的小膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志，結(jié)果顯示在MCAo后第4天和第7天對照組與用藥組之間差異非常顯著。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示在腦室內(nèi)延遲注射caspase抑制劑Z-VAD-fmk后，ED-1陽性細(xì)胞數(shù)明顯少于對照組，這說明Z-VAD-fmk可以抑制炎性反應(yīng)。

由此說明，延遲注射Z-VAD-fmk可對腦缺血有神經(jīng)保護(hù)作用，它的作用途徑是多方面的，其中抑制炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡是兩個重要方式。

圖1 ED-1染色(DAB顯色×400)(箭頭所示陽性細(xì)胞);(A):Z-VAD-fmk治療1d(B):Z-VAD-fmk治療4d;(C):Z-VAD-fmk治療7d;(D):對照1d;(E):對照4d;(F):對照7d

圖2 TUNEL染色(DAB顯色×400)(箭頭所示陽性細(xì)胞);(A):Z-VAD-fmk治療1d(B):Z-VAD-fmk治療4d;(C):Z-VAD-fmk治療7d;(D):對照1d;(E):對照4d;(F):對照7d

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