邵林華， 孫青芳， 卞留貫， 陳亦華， 程振宇， 鄭 龍， 俞建華， 張晨冉， 顧呂偉

VEGF是一種促進(jìn)血管形成和分化的重要調(diào)節(jié)因子，同時具有神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)營養(yǎng)的特性［1］，同時它是一種分泌性蛋白，即使少量表達(dá)也能取得理想的生物學(xué)效應(yīng)，因此被認(rèn)為是可減輕腦缺血損傷的潛在的治療方法［2］。但由于直接輸注外源性的細(xì)胞因子，有著半衰期短、劑量大、反復(fù)操作易感染的缺點(diǎn);以質(zhì)粒為載體的VEGF基因轉(zhuǎn)染效率一般又較低(通常小于1%)，此外，如果腦缺血梗死區(qū)的神經(jīng)元和星形細(xì)胞損傷較為嚴(yán)重，即使轉(zhuǎn)染效率不低，也會導(dǎo)致蛋白合成障礙［3］，所以VEGF基因治療腦缺血很難在臨床實(shí)際工作中展開。如何使外源性VEGF高表達(dá)，就成了國內(nèi)外研究的焦點(diǎn)。

受到國外學(xué)者將血管生長素-1和VEGF基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植入MACO大鼠模型用以治療腦缺血嘗試的啟發(fā)［4］，我們想到或許可以借移植細(xì)胞來解決腦缺血區(qū)域質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率低下或轉(zhuǎn)染后蛋白表達(dá)低下的問題。由于成纖維細(xì)胞能分泌多種與血管形成有關(guān)的活性肽，移植后繼續(xù)生長、增殖，可能對移植處的血管化具有重要作用［5］。于是，本次實(shí)驗(yàn)我們就擬通過比較定向移植輸注表達(dá)VEGF的成纖維細(xì)胞和原位注射rAAV-VEGF基因?qū)Υ笫竽X缺血的療效，為如何進(jìn)行VEGF基因治療急性腦缺血疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 健康成年雄性SD大鼠30只，SPF級，體重250～350g，月齡10個月，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司提供。每籠飼養(yǎng)6只，飼養(yǎng)室溫度控制在20℃ ～22℃ ，明暗光照每日各12h。隨機(jī)分為5組:(1)假手術(shù)組，切開左側(cè)旁正中皮膚，用直徑為0.265mm的尼龍線從頸外動脈(ECA)殘瑞插入約1cm到達(dá)頸內(nèi)動脈(ICA)與翼腭動脈(PPA)分叉處，縫合皮下組織及皮膚后，放籠內(nèi)精心飼養(yǎng);(2)MCAO組，按Longa等［6］描述的大腦中動脈線栓閉塞法(MCAO)制備大鼠局灶性腦缺血動脈閉塞;(3)移植輸注組;(4)直接注射組，都先按照上述方法制成MCAO，術(shù)后24h內(nèi)，于大鼠前囟偏左5mm、向后3mm處鉆一小孔，用微量注射器進(jìn)針約3.5mm，分3個注射點(diǎn)注入共100μl表達(dá) VEGF的成纖維細(xì)胞(1.0×106cells/ml)或 rAAV-VEGF載體，病毒滴度均為2.0×1012vg(vector genomes)/ml;(5)正常對照組。

1.2 方法

1.2.1 VEGF-成纖維細(xì)胞的制備

1.2.1.1 重組腺相關(guān)病毒載體 rAAV-VEGF購自上海瑞鹿生物技術(shù)有限公司，均含有CMV啟動子。

1.2.1.2 成纖維細(xì)胞的制備 1個月齡SD大鼠后肢脫毛、消毒、取皮、去除皮下結(jié)締組織，PBS反復(fù)沖洗后剪成約0.5mm3，培養(yǎng)、傳代，實(shí)驗(yàn)用第3～4代的細(xì)胞。

1.2.1.3 成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)染和鑒定 感染前24h胰酶消化細(xì)胞，按1×105接種至6孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞約70%融合時轉(zhuǎn)染。加入病毒上清，轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞，同時加入800μg/ml的polybrene，使其終濃度為16μg/ml，8h后換800μg/ml G418的新鮮液DMEN(10%FCS)進(jìn)行篩選，直至陽性克隆出現(xiàn)。消化細(xì)胞，用Trizol試劑進(jìn)行總RNA的抽提，用RTPCR法檢測VEGF的表達(dá)，VEGF引物序列上游:5’-GGTACCTCCGAAACCATGAACTTT-3’，下游:5’-GGATCCTTCATTTCAGGTTTCTGG-3’，目的片段大小為464bp。GAPDH作為內(nèi)參，引物序列:上游5’-gcaagagagaggccctcag-3’，下游 5’-tgtgagggagatgctcagtg-3’，目的片段大小為205bp。

1.2.2 VEGF mRNA 檢測

1.2.2.1 腦組織總 RNA的抽提用Trizol試劑進(jìn)行總RNA的抽提，使用ND-1000核酸蛋白測定儀(美國Nano Drop公司)測定RNA的濃度和質(zhì)量，瓊脂糖凝膠電泳檢查總RNA抽提的質(zhì)量。

1.2.2.2 逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增取2μg總RNA樣品，根據(jù)TAKARA RT-PCR一步法試劑盒的說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性 5min;94℃45s、60℃45s、72℃1min，共 25 個循環(huán);再72℃10min，4℃保存。擴(kuò)增結(jié)束后取PCR產(chǎn)物上樣，在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)對條帶進(jìn)行掃描分析，根據(jù)各組樣本GAPDH內(nèi)參的PCR產(chǎn)物條帶的灰度值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，再比較各組VEGF基因PCR產(chǎn)物的相對表達(dá)量。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色

1.2.3.1 標(biāo)本制作 術(shù)后14d，各組大鼠均斷頭取腦，從額端向枕端連續(xù)做腦正中冠狀面切片，每片2mm，并迅速放入4%多聚甲醛固定液中，置4℃～6℃ 固定2d。常規(guī)脫水、石蠟包埋，8μm厚度切片。LDP法免疫組化染色。

1.2.3.2 操作步驟 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水;用高壓鍋加熱法，0.01mol/L pH 6.0檸檬酸進(jìn)行抗原修復(fù);3%過氧化氫消除內(nèi)源性過氧化物酶15min;加第一抗體(VEGF)室溫30min，PBS洗3次;加第二抗體(EnVision-HRP)孵育30min，PBS洗3次;DAB顯色;蘇木素復(fù)染胞核;常規(guī)脫水、透明、封片。

1.2.3.3 陽性細(xì)胞計數(shù) 每個標(biāo)本在梗死灶邊緣區(qū)或假手術(shù)組的皮質(zhì)區(qū)各取10個視野統(tǒng)計VEGF免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)，其均值即為該標(biāo)本的陽性細(xì)胞數(shù)密度。

1.2.4 大鼠腦梗死的染色 術(shù)后14d，各組大鼠均斷頭取腦，取腦正中冠狀面，每片2mm，切下后迅即放入37℃ 的4%TTC溶液中染色30min。觀察各腦片首尾兩面的梗死情況。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用 SPSS 12.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，各組內(nèi)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，各組間差異顯著性的比較采用ANOVA方法，設(shè)定P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VEGF表達(dá)的檢測 根據(jù)5組大鼠大腦樣本GAPDH內(nèi)參的PCR產(chǎn)物條帶灰度值標(biāo)準(zhǔn)化后，比較各組VEGF基因PCR產(chǎn)物的相對表達(dá)量(見圖1)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):假手術(shù)組和正常對照組的VEGF表達(dá)量基本相同，移植輸注組和直接注射組的VEGF基因表達(dá)均明顯增高，但移植輸注組增高更顯著，而MCAO組VEGF基因的表達(dá)量較正常對照組低。

2.2 腦缺血邊緣區(qū) VEGF陽性細(xì)胞檢測VEGF免疫組織化學(xué)染色的著色部位在細(xì)胞漿，呈黃褐色，即為VEGF陽性細(xì)胞。腦梗死后，缺血邊緣區(qū)會有較多的神經(jīng)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞以及少量的膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)VEGF蛋白;而正常腦組織中只有極少數(shù)的神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)。本次實(shí)驗(yàn)中，直接注射組、移植輸注組中的VEGF蛋白表達(dá)水平顯著增強(qiáng)，MCAO組則較弱(見表1)。

2.3 大鼠缺血腦組織壞死情況 正常腦組織經(jīng)TTC染色后呈均勻鮮紅色，而腦缺血后的梗死區(qū)則呈灰白色。正常對照組和假手術(shù)組基本相同，而MCAO組腦梗死體積百分比較大，直接注射組、移植輸注組和聯(lián)合治療組的腦梗死體積百分比明顯縮小，其中聯(lián)合治療組減小最明顯(見圖2)。

表1 各組大鼠腦缺血邊緣區(qū)VEGF陽性細(xì)胞密度

圖1 5組大鼠腦組織VEGF和GAPDH mRNA表達(dá)

圖2 各組大鼠腦梗死面積比較

3 討論

目前，缺血性腦血管病的治療方法主要還是通過溶栓、抗凝、抗血小板聚集等，防治血栓和擴(kuò)張血管等傳統(tǒng)方法來改善血液供應(yīng)。創(chuàng)傷修復(fù)的現(xiàn)代概念認(rèn)為，創(chuàng)傷修復(fù)是多種細(xì)胞、生長因子和細(xì)胞外基質(zhì)之間相互作用的復(fù)雜的動態(tài)過程，成纖維細(xì)胞可以通過自分泌和旁分泌機(jī)制產(chǎn)生生長因子，作用于自身及其它細(xì)胞，調(diào)控修復(fù)過程，在整個修復(fù)過程中起著基礎(chǔ)與關(guān)鍵的作用［7］。VEGF是一種促進(jìn)血管形成和分化的重要調(diào)節(jié)因子，同時具有神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)營養(yǎng)的特性，因此給予外源性VEGF被認(rèn)為是可減輕腦缺血損傷的潛在的治療方法［8］。本次實(shí)驗(yàn)把轉(zhuǎn)染了VEGF基因的成纖維細(xì)胞移植入腦進(jìn)行缺血區(qū)域的治療。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正常對照組和假手術(shù)組大鼠的腦組織中有少量的血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)VEGF;MCAO組大鼠的缺血腦組織尤其是缺血邊緣區(qū)的血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞的VEGF表達(dá)增強(qiáng)，但增強(qiáng)的程度有限，可能僅是一種反應(yīng)性的增強(qiáng)。而大鼠腦缺血后通過移植轉(zhuǎn)染VEGF基因的成纖維細(xì)胞和直接注射導(dǎo)入rAAV-VEGF后，缺血邊緣區(qū)的血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞的VEGF表達(dá)則顯著增強(qiáng)，表明導(dǎo)入的外源性VEGF基因能夠在缺血腦組織中表達(dá)出VEGF;此外，腦組織壞死情況也有減輕、腦梗死體積縮小，這提示導(dǎo)入的外源性VEGF能促進(jìn)腦缺血邊緣區(qū)新生血管的形成和側(cè)支循環(huán)建立，通過改善腦血流進(jìn)而保護(hù)神經(jīng)元，達(dá)到減輕缺血性腦損傷的作用。移植轉(zhuǎn)染VEGF基因的成纖維細(xì)胞較直接注射rAAV-VEGF組的效果更為顯著，這可能與缺血區(qū)域的細(xì)胞功能受到不同程度的損傷從而影響了蛋白合成，而缺血部位移植的轉(zhuǎn)染VEGF基因的成纖維細(xì)胞未受此影響有關(guān)。但此治療手段效果與轉(zhuǎn)染效率和輸入細(xì)胞量有著明顯的關(guān)系;此外，對新生血管功能的評價等，都有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，通過移植轉(zhuǎn)染VEGF基因的成纖維細(xì)胞治療腦缺血能夠取得良好的效果，可能會成為一種較為合適而有效的治療途徑。

［1］Carmeliet P.Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis［J］.Nat Med，2000，6(3):389-395.

［2］Sun Y，Jin K，Xie L，et al.VEGF-induced neuroprotection，neurogenesis，and angiogenesis after focal cerebral ischemia［J］.J Clin Invest，2003，111:1843-1851.

［3］Losordo DW，Vale PR，Symes JF，et al.Gene therapy for myocardial angiogenesis:initial clinical results with direct myocardial injection of phVEGFl65 as sole therapy for myocardialischemia［J］.Circulation，1998，98(25):2800-2804.

［4］Toyama K，Honmou O，Harada K，et al.Therapeutic benefits of angiogenetic gene-modified human mesenchymal stem cells after cerebral ischemia［J］.Exp Neurol，2009，216(1):47-55.

［5］Lekic P，Mcculloch CA.Periodontal ligament cell populations:the central role of fibroblasts in creating a unique tissue［J］.Anat Rec，1996，245(2):327-341.

［6］Longa EZ，W eistein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20(1):84-91.

［7］傅小兵，孫同柱，王亞平，等.表皮細(xì)胞生長因子與堿性成纖維細(xì)胞生長因子促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)效應(yīng)的比較性研究［J］.中國修復(fù)重建外科雜志，1999，13(5):278.

［8］Yasuhara T，Shingo T，Kobayashi K，et al.Neuroprotective effects of vascular endothelial growth factor(VEGF)upon dopaminergic neurons in a rat model of Parkinson＇s disease［J］.Eur J Neurosci，2004，19(6):1494-1504.