呂建偉，李 茵，孫 麗（廣西柳州市中醫(yī)院藥劑科，柳州市 545001）

中藥注射劑配伍后的穩(wěn)定性是影響其安全性的主要因素之一，但以往對中藥注射劑配伍穩(wěn)定性的研究主要是采用高效液相色譜法[1]、紫外分光光度法[2]測定其中“有效成分”的含量，合并微粒檢測進(jìn)行考察，結(jié)果雖然均發(fā)現(xiàn)微粒增多，但“有效成分”的含量卻沒有變化，含量測定結(jié)果無法解釋微粒變化。中藥的紫外吸收光譜是由各組分特征吸收光譜疊加而成，中藥紫外光譜特征的差異在一定程度上反映了中藥化學(xué)成分的差異，能從中醫(yī)的“整體觀”反映微量成分的變化。溫度是影響中藥注射劑穩(wěn)定性的重要因素之一，而以往的中藥注射劑穩(wěn)定性試驗(yàn)均沒有考察這一因素[3]。因此，本試驗(yàn)通過比較不同溫度下注射用丹參無菌粉末紫外相似度的大小，以為注射用丹參的保存和配伍溫度提供參考。

1 儀器與試藥

AL204電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；UV-1601紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；GWJ-4微粒檢測儀（天津大學(xué)精密儀器廠）。

注射用丹參（哈藥集團(tuán)中藥二廠，規(guī)格：400 mg，批號(hào)：090333）；0.9%氯化鈉溶液（武漢濱湖雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：090504901）。

2 方法與結(jié)果

2.1 配伍液的配制

用0.9%氯化鈉溶液，分別在5、10、20、30、40 ℃下將注射用丹參配制成濃度為0.8 mg·mL-1的溶液（雖然5%葡萄糖注射液和0.9%氯化鈉溶液對注射用丹參的穩(wěn)定性影響均較小[4]，但5%葡萄糖注射液具有較明顯的末端吸收，為盡量避免對測試樣品紫外圖譜的影響，本試驗(yàn)選用0.9%氯化鈉溶液為配伍液進(jìn)行試驗(yàn)），并相應(yīng)標(biāo)記為A、B、C、D、E，即為試驗(yàn)用配伍液。

2.2 配伍液7 h外觀變化

取上述各配伍液，分別于0、1、2、3、4、5、6、7 h觀察其外觀變化（沉淀、氣泡、顏色變化）。結(jié)果表明，所有配伍液均未出現(xiàn)顏色變化，均無沉淀、氣泡產(chǎn)生。

2.3 紫外光譜掃描條件

精密量取上述C溶液2 mL，置于25 mL容量瓶中，加注射用水至刻度。選擇波長范圍200～400 nm、吸光度記錄范圍－0.10～3.999、波長間隔0.5 nm、掃描速度中速、石英比色皿厚度1 cm，以掃描3次光譜數(shù)據(jù)平均值作為配伍液最終紫外光譜數(shù)據(jù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，配伍液在281 nm波長處有最大吸收。

2.4 配伍液穩(wěn)定性的紫外光譜相似度考察

精密量取上述A～E溶液各2 mL，用0.9%氯化鈉溶液稀釋至25 mL，相應(yīng)標(biāo)記為A1、B1、C1、D1、E1。以0.9%氯化鈉溶液作空白對照，按“2.3”項(xiàng)下條件分別于0、1、2、3、4、5、6、7 h進(jìn)行紫外掃描，并根據(jù)紫外光譜相似度公式計(jì)算相似度值。

紫外光譜相似度計(jì)算公式[5]：

式中，S為相似度，h1、h2為兩光譜曲線某一對應(yīng)采樣點(diǎn)的吸光度，1/n為權(quán)重系數(shù)，絕對值表示由于吸光度的差異而使它們相似度降低的程度。如果兩光譜曲線所有采樣點(diǎn)的吸光度都相等，則S等于1；兩光譜曲線的采樣點(diǎn)吸光度相差越大，S越小。S能夠定量反映出兩紫外吸收曲線的相似程度：如果配伍液在7 h內(nèi)的S較大且都接近，那么就可以表明配伍后藥物質(zhì)量成分基本穩(wěn)定；若S較小或相差較大，則表明兩藥物配伍后穩(wěn)定性下降。

2.4.1 權(quán)重的設(shè)置 對200～400 nm波長范圍內(nèi)的紫外吸收光譜進(jìn)行全程比較，涉及400個(gè)波長點(diǎn)對應(yīng)的紫外吸收值。由于其中的峰和谷往往表達(dá)著藥品的重要特征，因此應(yīng)在峰和谷的周圍設(shè)置較大的權(quán)重[6]。此外，藥物的“有效成分”也應(yīng)占有較大的權(quán)重。根據(jù)丹參中水溶性酚酸類在紫外區(qū)（281±3）nm波長處有最大吸收、原兒茶醛在268 nm波長處[7]有最大吸收，酯溶性成分丹參酮ⅡA和隱丹參酮在254 nm波長處有最大吸收[8]，選擇在250～290 nm波長處也設(shè)置較大權(quán)重。同時(shí)，由于紫外吸收的吸光值最好在0.1～1.5A，以最大程度減少顆粒對測試結(jié)果的影響，因此對吸光值＜0.1或＞1.5的均應(yīng)設(shè)置較小權(quán)重。本研究采用層次分析法（AHP）[9]設(shè)定權(quán)重系數(shù)。AHP是由美國科學(xué)家T L Saaty在20世紀(jì)70年代提出的，是一種解決多目標(biāo)的復(fù)雜問題的定性與定量相結(jié)合的決策分析方法，它是用決策者的經(jīng)驗(yàn)來判斷各衡量目標(biāo)能否實(shí)現(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)之間的相對重要程度，并合理地給出每個(gè)決策方案的各標(biāo)準(zhǔn)的權(quán)重，利用權(quán)重系數(shù)求出各方案的優(yōu)劣次序。AHP的本質(zhì)是試圖使人的思維條理化、層次化，它充分利用人的經(jīng)驗(yàn)和判斷，并予以量化，進(jìn)而對決策方案進(jìn)行排序。

結(jié)合圖譜，本試驗(yàn)將200～400 nm波長范圍分為6段，每段的權(quán)重采用AHP進(jìn)行研究，具體步驟如下：（1）建立評價(jià)目標(biāo)樹。將200～400 nm波長分為6段，分別為200～220、221～240、241～270、271～290、291～310、311～400 nm。（2）構(gòu)成兩兩比較優(yōu)先矩：比較同一層次目標(biāo)的相對重要性，并構(gòu)成兩兩比較矩陣。目標(biāo)樹圖各層次評分標(biāo)準(zhǔn)見表1；目標(biāo)樹中6項(xiàng)目標(biāo)成對比較判斷優(yōu)先矩陣見表2。

表1 目標(biāo)樹圖各層次評分標(biāo)準(zhǔn)Tab1 Point standard to different hierarchy of goaltree

表2 目標(biāo)成對比較判斷優(yōu)先矩陣Tab2 Comparison judgment of priority matrix between couple objects

表3 平均隨機(jī)一致性指標(biāo)RI表Tab3 RI table of average random coincidence indicator

表4 權(quán)重系數(shù)Tab4 Weight coefficient

2.5 試驗(yàn)結(jié)果

2.5.1 紫外光譜圖變化及紫外光譜相似度計(jì)算結(jié)果 由于紫外吸收光譜只有1個(gè)或幾個(gè)寬帶吸收，曲線的形狀變化不多，連續(xù)監(jiān)測同一樣品溶液得到的紫外光譜應(yīng)該是連續(xù)變化的。因此，本試驗(yàn)擬設(shè)定0 h的相似度為1，相鄰時(shí)間點(diǎn)測到的相似度為相對相似度，而間隔時(shí)間點(diǎn)測到的相似度（絕對相似度）為各相鄰時(shí)間點(diǎn)的相對相似度乘積。計(jì)算方法：相對紫外光譜相似度為配伍后1 h與前1 h對比得出的相似度，如以配伍后1 h與0 h紫外光譜數(shù)據(jù)計(jì)算出相似度S1，以此類推，以2 h與1 h、3 h與2 h、4 h與3 h紫外光譜數(shù)據(jù)計(jì)算出的相似度分別為S2、S3、S4。再以S2與S1相乘得到2 h相對于0 h的絕對相似度S2a，以S3與S2a相乘得到3 h相對于0 h的絕對相似度S3a，以S4與S3a相乘得到4 h相對于0 h的絕對相似度S4a，以此類推。相對紫外光譜相似度（與0 h的測定圖譜對比，0 h紫外光譜相似度設(shè)為1）見表5；絕對紫外光譜相似度（與0 h的測定圖譜對比，0 h紫外光譜相似度設(shè)為1）見表6。

表5 7 h內(nèi)的相對紫外光譜相似度Tab5 Similarity of relative UV spectrum in 7 h

表6 7 h內(nèi)的絕對紫外光譜相似度Tab6 Similarity of absolute UV spectrum in 7 h

2.5.2 單變量雙因素方差分析結(jié)果 試驗(yàn)結(jié)果用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，使用普通線性模型（General Liner Model）的單變量雙因素方差分析方法。定義不同溫度注射用丹參的紫外光譜相似度值為因變量，定義時(shí)間和溫度為固定因素變量，采用主效應(yīng)方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)。結(jié)果，相對紫外光譜相似度的F＝1.05，P＞0.05；絕對紫外光譜相似度的F＝12 271.796，P＜0.01。多重比較結(jié)果顯示，任意兩個(gè)配伍液的相對紫外光譜相似度比較均不存在顯著性差異（P＞0.05），而絕對紫外光譜相似度比較均存在非常顯著的差異（P＜0.01）。

2.5.3 紫外光譜相似度變化圖譜 在200～400 nm波長范圍內(nèi)，以0.5 nm為一個(gè)采樣點(diǎn)，根據(jù)“2.4”項(xiàng)下公式計(jì)算每一采樣點(diǎn)的紫外光譜相似度值；并以此為縱坐標(biāo)，以波長為橫坐標(biāo)，分別繪制7 h內(nèi)5、10、20、30、40℃下注射用丹參的紫外光譜相似度變化圖譜，詳見圖1。

3 討論

結(jié)合紫外光譜相似度值（表5、表6）及方差分析結(jié)果可知，溫度對注射用丹參的穩(wěn)定性有一定影響。溫度為20℃時(shí)的配伍液最穩(wěn)定，其次依次為30、40、10、5℃時(shí)的配伍液。方差分析結(jié)果顯示，各配伍液相對紫外光譜相似度比較無顯著差異，而絕對紫外光譜相似度比較差異顯著，表明各配伍液在相鄰時(shí)間段成分變化不大，但時(shí)間跨度長時(shí)，藥物成分可產(chǎn)生顯著變化。

圖1 7 h內(nèi)各溫度下注射用丹參紫外光譜相似度變化圖譜A.5℃；B.10℃；C.20℃；D.30 ℃；E.40 ℃Fig1 Change map of the similarity of UV spectrum of Danshen for injection under different temperatures in 7 hA.5℃；B.10℃；C.20℃；D.30 ℃；E.40 ℃

從紫外光譜相似度變化圖譜可知，紫外光譜相似度的變化在低溫時(shí)（≤10℃），配伍之初即發(fā)生劇烈變化；而在20℃以上時(shí)，變化主要發(fā)生于配伍后幾小時(shí)。而且，紫外光譜相似度在低溫時(shí)所有波長段均產(chǎn)生較大變化；而在20℃以上時(shí)，其變化主要發(fā)生于310 nm波長段之后。據(jù)此推測低溫可能對注射用丹參穩(wěn)定性的影響更大。我院中藥注射劑不良反應(yīng)報(bào)告時(shí)間大多集中在冬春季節(jié)，除了輸液溫度過低對患者機(jī)體產(chǎn)生不良影響外，還可能與低溫對中藥注射劑穩(wěn)定性影響較大有關(guān)。因此，當(dāng)環(huán)境溫度較低時(shí)，應(yīng)盡量避免使用中藥注射劑。

從紫外光譜相似度變化圖譜可知，所有配伍液的紫外相似度差異最大的波長段均位于310 nm之后，而該波長段所對應(yīng)的成分并非注射用丹參的“有效成分”。由此可知，“有效成分”并非為引起注射用丹參穩(wěn)定性變化的主要成分。由于藥物在研發(fā)過程中著重考慮“有效成分”的穩(wěn)定性問題，因此“有效成分”已能通過添加各種增溶劑、助溶劑或改變藥物分子結(jié)構(gòu)等方式保證其成分的穩(wěn)定性；但對于中藥注射劑中的“雜質(zhì)”如蛋白質(zhì)、糖類、鞣質(zhì)等未能給予足夠重視，因此其穩(wěn)定性難以得到保證。

多數(shù)中藥注射劑配伍穩(wěn)定性研究的考察指標(biāo)為單一的藥物“有效成分”，再結(jié)合pH值和不溶性微粒變化進(jìn)行檢測。但中藥中的多成分可能對pH值有緩沖作用，即使pH值相差較遠(yuǎn)的藥物與中藥注射劑配伍后，pH值并沒有較大改變；不溶性微粒的測定結(jié)果受多種因素的影響[10]，包括重復(fù)測量、儀器的校準(zhǔn)狀態(tài)、裝量差異、實(shí)驗(yàn)人員操作帶來的不確定度以及實(shí)驗(yàn)室的供電電壓、溫度等。正是由于上述原因，即使配伍后溶液的pH值、藥物的“有效成分”含量均無變化，紫外掃描的波峰和波谷位置及波型均無變化，不溶性微粒的增加也無法解釋上述試驗(yàn)結(jié)果[11～13]，也說明不了配伍后藥品不良反應(yīng)增加的原因[14]。使用紫外光譜相似度對中藥配伍液進(jìn)行穩(wěn)定性考察，可以從紫外光譜特征的差異了解中藥化學(xué)成分的差異，從而從中醫(yī)的“整體觀”反映微量成分的變化，可作為傳統(tǒng)方法考察中藥注射劑配伍穩(wěn)定性的補(bǔ)充。

本試驗(yàn)只是采用紫外光譜相似度的方法對藥物配伍條件進(jìn)行優(yōu)選。因?yàn)闆]有合適的對照品和相似度的評價(jià)閾值，該方法尚不能作為一個(gè)技術(shù)指標(biāo)來考察藥物是否能夠配伍。今后仍需不斷完善技術(shù)方案和研究內(nèi)容，使其能作為中藥注射劑的有效質(zhì)量控制方法。

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