張莉，高志軍，趙靜（.西藏大學(xué)醫(yī)學(xué)院，拉薩市850000；.西藏當雄縣人民醫(yī)院，當雄縣85500）

嚴重燒燙傷早期因腸黏膜屏障功能受損會導(dǎo)致腸道細菌和內(nèi)毒素移位，激活炎癥以及后續(xù)的代償性抗炎反應(yīng)和免疫系統(tǒng)自我保護作用，最終導(dǎo)致機體免疫失衡，從而引起全身炎癥反應(yīng)綜合征（Systemic inflammatory response syndrome，SIRS），進而導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征（Multiple Organs Dysfunction syndrome，MODS）。國外研究證實，大鼠Toll樣受體4（TLR4）信號通路及下游相關(guān)的效應(yīng)分子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）參與了燒傷后炎癥的發(fā)生[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，作為TLR4的配體脂多糖（LPS）也在燒傷后續(xù)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用[2，3]。

美寶濕潤燒傷膏（MEBO）主要成分包括黃連、黃柏、黃芩、地龍、罌粟殼，具有清熱、解毒、止痛、生肌功效，廣泛用于治療各種燒、燙、灼傷。在本研究中，筆者將MEBO運用于燙傷大鼠，觀察其對燙傷大鼠創(chuàng)面愈合和TLR4/LPS信號通路及TNF-α、IL-6的影響，初步闡明其對燙傷后炎癥的相關(guān)作用機制，為燒燙傷創(chuàng)面愈合的臨床治療提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

FACS Calibur型流式細胞儀（美國BD公司）；680型全波長酶標檢測儀（美國Bio-Rad公司）；721型分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司）；內(nèi)毒素檢測試劑（鱟試劑）動態(tài)檢測儀（北京時代新光生物技術(shù)有限公司）。

1.2 試藥

MEBO（汕頭市美寶制藥有限公司，批號：Z20000004）；鱟試劑（上海坤肯生物化工有限公司）；PE標記的大鼠TLR4單克隆抗體、FITC標記的鼠免疫球蛋白G（IgG）均購自美國BD公司；紅細胞裂解液、TNF-α、IL-6 ELISA檢測試劑盒（深圳晶美生物技術(shù)公司）。

1.3 動物

大鼠30只，♂，體重280～320 g，由第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供（動物合格證號：24301050）。

2 方法

2.1 模型的復(fù)制和分組、給藥

將30只SD大鼠隨機均分為空白對照、模型對照和MEBO組。除空白對照組外，其它大鼠在清醒狀態(tài)下，以200 g·L-1硫化鈉背部脫毛；200 g·L-1的烏拉坦溶液按5 mL·kg-1ip麻醉，置電熱恒浴中致背部燙傷（108℃，8 s），復(fù)制深Ⅱ度（經(jīng)病理證實）燙傷模型，燙傷后ip生理鹽水（40 mL·kg-1）抗休克。創(chuàng)面處理方式：模型對照組大鼠燙傷后讓創(chuàng)面暴露；MEBO組大鼠燙傷后涂MEBO于創(chuàng)面（厚度薄于1 mm），每8 h更換新藥。注意換藥前需將殘留在創(chuàng)面上的藥物及液化物拭去，同時暴露創(chuàng)面。燙傷后大鼠分籠飼養(yǎng)。觀察期間未發(fā)生明顯感染癥狀。

2.2 標本收集

將空白對照和MEBO組大鼠在燙傷后各時相點麻醉，無菌條件下經(jīng)尾靜脈采集靜脈血，一部分置于去熱源肝素化試管中，3 000 r·min-1、4℃下收集血漿；一部分置于去內(nèi)毒素的干凈試管中自凝，3 000 r·min-1、4℃下收集血清。樣本于－70℃貯藏，備用。

2.3 大鼠創(chuàng)面愈合情況觀察

每日觀察傷口愈合情況，以創(chuàng)面完全上皮化、無滲出作為創(chuàng)面完全愈合依據(jù)，同時記錄創(chuàng)面愈合時間；按Nagelschmidt法[6]計算各時相點創(chuàng)面愈合率：用透明稱量紙（7.5 cm×7.5 cm，平均重量約為0.156 8 g）覆蓋于大鼠背部創(chuàng)面，將創(chuàng)面邊緣清晰描繪在透明稱量紙上，僅保留曲線繪制所圍的面積并稱重。創(chuàng)面面積＝（7.5 cm×7.5 cm×紙片重）/0.156 8 g；創(chuàng)面愈合率/%＝（原始創(chuàng)面面積－未愈合創(chuàng)面面積）/原始創(chuàng)面面積×100%。

2.4 LPS檢測

參考鱟試劑檢測說明書，采用濁度法（內(nèi)毒素檢測法）檢測各組大鼠血漿中內(nèi)毒素含量。其原理是當被檢測的樣品中含有內(nèi)毒素時，鱟試劑會變混濁。內(nèi)毒素含量與混濁程度呈正比，可準確量化被檢測樣品中內(nèi)毒素的含量。顯色后采用分光光度計于540 nm波長處測定吸光度值。根據(jù)標準曲線求得大鼠血漿中LPS含量。

2.5 ELISA檢測

采用ELISA檢測大鼠血清中TNF-α、IL-6的表達水平，按說明書進行操作。

2.6 流式細胞術(shù)檢測

抽取EDTA抗凝靜脈血2 mL，采用細胞分離柱方法進行，在無菌情況下采用淋巴細胞分離液方法分離淋巴細胞，熒光抗體標記的淋巴細胞懸液4℃條件下避光孵育30 min，PBS洗滌3次，每次5 min。取1×106個·mL-1細胞標記的抗TLR4-PE單克隆抗體和抗FITC-IgG單克隆抗體，上流式細胞儀進行檢測。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

所有計量資料均采用±s表示；TNF-α含量、IL-6含量用χ2檢驗行統(tǒng)計學(xué)分析；LPS含量用t檢驗及單因素方差分析。采用SPSS 11.0軟件進行統(tǒng)計，P＜0.05為差異有顯著性。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠創(chuàng)面愈合時間及不同時相點創(chuàng)面愈合率

相對于模型對照組[（22.83±2.82）d]，MEBO組大鼠創(chuàng)面愈合時間[（17.25±1.78）d]顯著縮短（P＜0.01）。各組大鼠創(chuàng)面愈合時間見表1。

表1 各組大鼠創(chuàng)面愈合時間（±s，n＝10）Tab1 Healing time of wound in each grou（±s，n＝10）

表1 各組大鼠創(chuàng)面愈合時間（±s，n＝10）Tab1 Healing time of wound in each grou（±s，n＝10）

與模型對照組比較：＊P＜0.01vs.model control group：＊P＜0.01

創(chuàng)面愈合時間/d 22.83±2.82 17.25±1.78＊組別模型對照組MEBO組

在傷后的前3天，MEBO組大鼠與模型對照組比較，創(chuàng)面愈合率無顯著差異（P＞0.05）；從第7天至第21天，MEBO可明顯促進燙傷大鼠的創(chuàng)面愈合（P＜0.01或P＜0.05）。不同時相點各組大鼠創(chuàng)面愈合率見表2。

3.2 各組大鼠血漿中LPS含量變化

表2 不同時相點各組大鼠創(chuàng)面愈合率（±s，n＝10）Tab2 Healing rate of wound in each group at different time point（±s，n＝10）

表2 不同時相點各組大鼠創(chuàng)面愈合率（±s，n＝10）Tab2 Healing rate of wound in each group at different time point（±s，n＝10）

與模型對照組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.model control group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別模型對照組MEBO組不同時相點的愈合率/%28 d 100 100 1 d 2.03±0.32 1.98±0.30 3 d 10.69±2.32 11.84±3.89 7 d 36.87±6.25 41.88±8.03＊14 d 70.56±12.20 85.46±13.74＊＊21 d 92.07±14.64 100＊＊

傷后第1天至第7天，模型對照組大鼠血漿中LPS含量逐漸升高，于第7天達到頂峰后逐漸降低；與模型對照組比較，從第7天至第21天，不同時相點MEBO可顯著降低燙傷大鼠血漿中LPS含量（P＜0.01或P＜0.05）。不同時相點各組大鼠血漿LPS含量變化見表3。

3.3 傷后各組大鼠血清中TNF-α和IL-6含量變化

表3 不同時相點各組大鼠血漿LPS含量變化（±s，n＝10）Tab3 The content of LPS in rat plasma at different time point（±s，n＝10）

表3 不同時相點各組大鼠血漿LPS含量變化（±s，n＝10）Tab3 The content of LPS in rat plasma at different time point（±s，n＝10）

與模型對照組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.model control group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別模型對照組MEBO組不同時相點的LPS含量/μg·mL-1 28 d 0.73±0.17 0.69±0.18 1 d 0.70±0.11 0.73±0.10 3 d 0.72±0.14 0.69±0.12 7 d 1.23±0.34 0.91±0.26＊＊14 d 0.98±0.22 0.76±0.19＊＊21 d 0.85±0.18 0.71±0.16＊

第1天至第28天，模型對照組大鼠血清中TNF-α的水平逐漸降低；與模型對照組比較，從第7天至第28天，MEBO可有效降低燙傷模型大鼠血漿中TNF-α含量（P＜0.01或P＜0.05）。不同時相點各組大鼠血清TNF-α含量變化見表4。

表4 不同時相點各組大鼠血清TNF-α含量變化（±s，n＝10）Tab 4The content of TNF-α in rat plasma at different time point（±s，n＝10）

表4 不同時相點各組大鼠血清TNF-α含量變化（±s，n＝10）Tab 4The content of TNF-α in rat plasma at different time point（±s，n＝10）

與模型對照組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.model control group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

模型對照組MEBO組0.56±0.19 0.43±0.13＊＊1.38±0.35 1.43±0.38 0.98±0.27 0.93±0.26 0.78±0.18 0.61±0.20＊0.70±0.22 0.58±0.18＊0.63±0.21 0.51±0.16＊＊

模型對照組大鼠血清中IL-6于第3天達到最高峰，隨后緩慢下降；經(jīng)MEBO處理后，大鼠血清中IL-6的表達水平于第7天開始顯著下降（P＜0.01或P＜0.05）。不同時相點各組大鼠血清IL-6含量變化見表5。

表5 不同時相點各組大鼠血清IL-6含量變化（±s，n＝10）Tab5 The content of IL-6 in rat plasma at different time points（±s，n＝10）

表5 不同時相點各組大鼠血清IL-6含量變化（±s，n＝10）Tab5 The content of IL-6 in rat plasma at different time points（±s，n＝10）

與模型對照組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.model control group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

模型對照組MEBO組110.00±21.44 108.41±21.96 105.33±20.63 104.01±21.63 143.45±23.26 145.54±22.90 135.69±21.77 128.95±20.10＊123.33±20.47 117.63±19.92＊118.88±20.85 109.79±18.64＊＊

3.4 各組大鼠外周血中TLR4百分率變化

模型對照組大鼠外周血中TLR4百分率逐漸升高，第14天達到最高峰，隨后緩慢下降；與模型對照組比較，MEBO組大鼠外周血中TLR4百分率于第7天開始顯著下降（P＜0.01或P＜0.05）。不同時相點各組大鼠血漿中TLR4百分率變化見表6。

表6 不同時相點各組大鼠血漿中TLR4百分率變化（±s，n＝10）Tab6 Percentage of TLR4 in rat plasma at different time point（±s，n＝10）

表6 不同時相點各組大鼠血漿中TLR4百分率變化（±s，n＝10）Tab6 Percentage of TLR4 in rat plasma at different time point（±s，n＝10）

與模型對照組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.model control group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別模型對照組MEBO組不同時相點的TLR4百分率/%1 d 1.70±0.24 1.72±0.22 3 d 2.80±0.33 2.78±0.30 7 d 5.58±0.57 4.65±0.43＊14 d 7.58±0.69 6.08±0.53＊＊21 d 5.96±0.94 5.19±0.81＊28 d 3.68±0.35 3.30±0.38

4 討論

燒、燙傷后各種炎癥細胞因子包括TNF-α、IL-1、IL-6大量釋放，從而引發(fā)和加重全身炎癥反應(yīng)[4，5]。近來研究發(fā)現(xiàn)，TLR4/LPS信號通路參與了燒傷后全身炎癥的發(fā)生[1]。

TLR家族是模式識別受體（Pattern recognition receptors，PRRs）中的一大類。TLR在人類進化過程中保持高度保守的分子適應(yīng)性免疫，能識別細菌、真菌、病毒，還包括瘧原蟲等寄生蟲[6]。這種受體最早在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，對果蠅的天然免疫起重要作用，后來在哺乳動物的體內(nèi)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了這類Toll受體，它們參與、介導(dǎo)了LPS等相關(guān)分子模式誘發(fā)的先天免疫，目前已發(fā)現(xiàn)的TLR有13種（TLR1-13）[7]。

TLR4是第一個被鑒定的人類Toll樣受體，是機體識別細菌LPS的模式識別受體。TLR4與LPS相互作用的機制目前認為：LPS與單個核細胞膜上的脂多糖結(jié)合蛋白（LPS binding protein，LBP）結(jié)合；同時，Toll/IL-1受體家族胞漿區(qū)的接合蛋白——髓樣分化蛋白（Myeloid ifferentiation protein 88，MyD88）分子通過與TLR的相互作用形成復(fù)合物，再通過MyD88分子中的死亡結(jié)構(gòu)域的同嗜作用募集IRAK（IL-1 receptor-associated kinase）與腫瘤壞死因子相關(guān)因子TRAT6（Tummor necrosis factor-associated factor 6）等信號途徑，激活核因子-κB（NF-κB），活化AP-1等轉(zhuǎn)錄因子，從而調(diào)節(jié)TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等細胞因子、黏附分子和炎癥因子的轉(zhuǎn)錄表達，進而影響免疫與炎癥反應(yīng)[8]。

在與燒傷相關(guān)的研究中傅穎珺等[9]發(fā)現(xiàn)，嚴重燒傷時大鼠脾臟TLR4 mRNA和蛋白水平以及早期的致炎細胞因子水平均明顯升高；同時研究還發(fā)現(xiàn)，嚴重燒傷時TLR4的上調(diào)可能是通過調(diào)節(jié)性T細胞來實現(xiàn)的。在本研究中筆者同樣發(fā)現(xiàn)，燙傷后第14天開始大鼠TLR4的表達水平明顯升高，其結(jié)果與王明青等[10]的研究基本一致。而經(jīng)過EMBO處理后，TLR4在燙傷大鼠外周血中的陽性表達率明顯下調(diào)。

MEBO作為一種有效的燒傷治療藥物，廣泛用于各種燒、燙、灼傷。本研究中，筆者以MEBO運用于燙傷大鼠，發(fā)現(xiàn)MEBO可有效縮短燙傷創(chuàng)面愈合時間并促進燙傷創(chuàng)面的愈合。筆者同樣觀察了燙傷大鼠血清中TLR4/LPS信號通路下游的效應(yīng)分子TNF-α和IL-6的表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，燙傷后第1天至第28天，模型對照組大鼠血清中TNF-α的水平逐漸降低，其結(jié)果與現(xiàn)有報道存在一定的差異。作為炎癥早期的致炎細胞因子，燙傷后TNF-α表達水平在24 h內(nèi)迅速升高，隨后逐漸降低。而在本研究中，由于沒有設(shè)定燙傷后更早的時相點，故沒有觀察到TNF-α在燙傷后24 h內(nèi)迅速上升的趨勢。IL-6作為炎癥中晚期出現(xiàn)上升趨勢的細胞因子，筆者觀察到燙傷后第3天IL-6升到最高峰，隨后緩慢下降。而經(jīng)過MEBO處理后，與模型對照組比較，大鼠血清中TNF-α和IL-6的水平明顯降低，提示MEBO具有對TNF-α和IL-6的有效抑制效應(yīng)。

在本研究中，筆者證實了MEBO對于燙傷創(chuàng)面愈合的促進作用，初步闡明了其作用機制可能與抑制TLR4/LPS信號通路及下游的致炎細胞因子TNF-α和IL-6的表達有關(guān)。但是，MEBO是如何調(diào)控TLR4/LPS信號通路中的調(diào)節(jié)分子從而促進燙傷創(chuàng)面愈合的，需要進一步研究。

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