陳立瑾，田利源，李秀麗，汪 莉，王玉民，陳樹林

（1.西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院，陜西 楊凌 712100；2.軍事醫(yī)學科學院 生物工程研究所，北京 海淀 100071）

附睪是連接睪丸和輸精管的細長管道，哺乳動物的精子在睪丸中生成后，并沒有達到功能上的成熟。在穿過附睪時，與附睪中的液體相互作用，才逐步獲得授精的能力［1-3］。附睪基因功能的研究已經(jīng)成為生殖生物學的一個熱點。

本文研究的fam12b基因?qū)儆谛∈蟾讲G基因，在小鼠出生后不久即有表達，且可以分泌到附睪腔中［4］。近來的研究將fam12b歸為RNase A超家族的新成員［5-6］。大部分RNase A基因在大鼠、小鼠和人中含有同源基因［7］，RNase A超家族成員具有多種生物學功能：可以降解核酸、抗菌、抗病毒［8］、抑制腫瘤生成［9］、參與哺乳動物內(nèi)源宿主防御［10-11］等。fam12b基因在小鼠附睪中高表達［4］，我們推測它可能參與了精子成熟的過程。目前還未見研究報道Fam12b蛋白的功能。

本試驗中我們克隆了小鼠附睪基因fam12b，串聯(lián)后連入pET28（a）載體，于大腸桿菌 Rosetta（DE3）中誘導(dǎo)表達，獲得高純度融合蛋白，為進一步研究Fam12b的功能創(chuàng)造了條件。

1 材料與方法

1.1 材料 8周齡C57雄鼠由北京軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供。

表達載體pET28（a）由國家儀器分析中心張學敏實驗室惠贈；大腸桿菌 DH5α、Rosetta（DE3），購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

試劑：動物組織總RNA提取試劑盒、普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒，均購自北京天根生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶Nde I、EcoRⅠ、HindⅢ、EcoR V、T4DNA連接酶，購自NEB生物公司；Ni-NTA親和柱，購自Qiagen公司；PCR引物合成及測序均由北京奧科生物技術(shù)有限責任公司完成。

1.2 目的基因fam12b的獲得 提取8周齡C57雄鼠附睪總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得相應(yīng)的cDNA。參照GenBank公布的序列（NM＿203508.1），用信號肽分析軟件（http：／／bmbpcu36.leeds.ac.uk／prot-analysis／signal）分析出信號肽序列，將去掉信號肽的序列擴增出來。擴增目的基因的兩種片段1和2，在片段1的5端引入NdeⅠ酶切位點，在3端引入Eco RⅠ酶切位點；在片段2的5端引入Eco RⅠ酶切位點，3端引入Hin dⅢ酶切位點。其中片段1不含終止密碼子，片段2含有終止密碼子。

設(shè)計引物如下（下劃線為酶切位點）：

1.3 表達載體的構(gòu)建及鑒定 片段1用NdeⅠ和Eco RⅠ雙酶切，片段2用Eco RⅠ和Hin dⅢ雙酶切，原核表達載體pET28（a）用Hin dⅢ、NdeⅠ雙酶切，產(chǎn)物用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。用Hin dⅢ和Eco R V雙酶切鑒定重組質(zhì)粒，酶切正確的質(zhì)粒由北京奧科生物技術(shù)有限責任公司測序。

1.4 融合蛋白的誘導(dǎo)表達 將測序正確的重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta（DE3）感受態(tài)細胞，37℃、200r／min振蕩培養(yǎng)過夜。次日轉(zhuǎn)接至新的液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)至OD600nm為0.6，加入終濃度為1mmol／L的IPTG，37℃誘導(dǎo)4h。收集1mL菌液，離心去上清加入溴酚藍緩沖液懸浮沉淀，處理后進行SDS-PAGE檢驗。

1.5 Western-blot鑒定目的蛋白 將1.4中菌體裂解液進行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)移至0.22μm的PVDF膜上，用封閉液室溫封閉1h，以His標簽抗體孵育1h，TBST洗滌，羊抗鼠IgG-HRP孵育1h，TBST洗滌，加入HRP化學發(fā)光檢測底物后在暗室顯影。

1.6 純化融合蛋白［12］將誘導(dǎo)成功的陽性菌液轉(zhuǎn)接至新的液體培養(yǎng)液中，37℃、200r／min振蕩培養(yǎng)至OD600nm為0.6，加入IPTG誘導(dǎo)，振蕩培養(yǎng)4h。離心收集菌體細胞，-20℃凍存。IPTG誘導(dǎo)前后的菌液各取1mL，SDS-PAGE檢測目的蛋白的表達。

取出凍存的菌體，按照QIAGEN蛋白純化試劑盒說明書進行純化，向10mL變性蛋白緩沖液B（pH值8.0）中加入500μL蛋白酶抑制劑溶液，混勻后加至菌體沉淀，室溫放置1h。然后離心取上清加至Ni-NTA蛋白純化柱，用變性蛋白緩沖液C（pH值6.3）洗滌2次后用變性蛋白緩沖液E（pH值4.5）洗脫3次。收集各步驟中流出的液體，SDS-PAGE檢驗。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的克隆 經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，PCR擴增產(chǎn)物約在380bp處有特異性條帶，與預(yù)期相符（圖1）。

圖1 fam12b基因的PCR擴增結(jié)果

2.2 重組載體的鑒定 構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)Hin dⅢ、Eco R V雙酶切鑒定，預(yù)期片段大小分別為2126bp與3969bp的片段，試驗結(jié)果與預(yù)期相符（圖2）。測序后顯示成功獲得序列完整且讀碼框正確的表達載體。

2.3 融合蛋白的誘導(dǎo)表達及鑒定 將1.4中處理的樣品進行SDS-PAGE分析，在約31kDa處檢測到蛋白表達的條帶。Western-blot鑒定顯示出在該位置處有特異性條帶（圖3）。

2.4 融合蛋白的親和純化 重組蛋白帶有His標簽，用Ni-NTA蛋白純化柱親和純化，收集各步驟中的液體，進行SDS-PAGE電泳檢測，如圖4。

3 討論

雄性哺乳動物的生殖道不容易被感染，很重要的一個原因是附睪上皮細胞會分泌一些蛋白，其中有些蛋白具有抗菌作用，保護精子可以順利通過生殖道［13］，精子在穿過附睪的過程中逐步成熟［14］。我們前期的工作用fam12b的單個基因連入pET28（a）載體，摸索了不同梯度的誘導(dǎo)劑濃度和誘導(dǎo)溫度，但是均未檢測到目的蛋白的表達；只有當兩個相同的基因串聯(lián)后，才能以融合蛋白的形式表達出來，我們推測該蛋白可能具有一定的抗菌能力，兩個基因串聯(lián)表達后，改變了天然存在蛋白的空間構(gòu)象，進而干擾了蛋白的抗菌能力，故可以在大腸桿菌Rosetta中表達出來。另外，小分子蛋白的免疫原性較小，采用串聯(lián)表達的方式可以增加該蛋白的免疫原性，便于制備抗體用于后續(xù)試驗研究。

4 結(jié)語

本試驗利用原核表達體系表達了小鼠附睪分泌蛋白Fam12b的融合蛋白，并獲得純度較好的蛋白，為制備其多克隆抗體奠定了基礎(chǔ)，為進一步研究Fam12b的功能創(chuàng)造了條件。

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