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        小鼠附睪分泌蛋白Fam12b的原核表達與純化

        2011-08-08 06:13:10陳立瑾田利源李秀麗王玉民陳樹林
        中國獸醫(yī)雜志 2011年11期
        關(guān)鍵詞:小鼠

        陳立瑾,田利源,李秀麗,汪 莉,王玉民,陳樹林

        (1.西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院,陜西 楊凌 712100;2.軍事醫(yī)學科學院 生物工程研究所,北京 海淀 100071)

        附睪是連接睪丸和輸精管的細長管道,哺乳動物的精子在睪丸中生成后,并沒有達到功能上的成熟。在穿過附睪時,與附睪中的液體相互作用,才逐步獲得授精的能力[1-3]。附睪基因功能的研究已經(jīng)成為生殖生物學的一個熱點。

        本文研究的fam12b基因?qū)儆谛∈蟾讲G基因,在小鼠出生后不久即有表達,且可以分泌到附睪腔中[4]。近來的研究將fam12b歸為RNase A超家族的新成員[5-6]。大部分RNase A基因在大鼠、小鼠和人中含有同源基因[7],RNase A超家族成員具有多種生物學功能:可以降解核酸、抗菌、抗病毒[8]、抑制腫瘤生成[9]、參與哺乳動物內(nèi)源宿主防御[10-11]等。fam12b基因在小鼠附睪中高表達[4],我們推測它可能參與了精子成熟的過程。目前還未見研究報道Fam12b蛋白的功能。

        本試驗中我們克隆了小鼠附睪基因fam12b,串聯(lián)后連入pET28(a)載體,于大腸桿菌 Rosetta(DE3)中誘導(dǎo)表達,獲得高純度融合蛋白,為進一步研究Fam12b的功能創(chuàng)造了條件。

        1 材料與方法

        1.1 材料 8周齡C57雄鼠由北京軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供。

        表達載體pET28(a)由國家儀器分析中心張學敏實驗室惠贈;大腸桿菌 DH5α、Rosetta(DE3),購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

        試劑:動物組織總RNA提取試劑盒、普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒,均購自北京天根生物科技有限公司;限制性內(nèi)切酶Nde I、EcoRⅠ、HindⅢ、EcoR V、T4DNA連接酶,購自NEB生物公司;Ni-NTA親和柱,購自Qiagen公司;PCR引物合成及測序均由北京奧科生物技術(shù)有限責任公司完成。

        1.2 目的基因fam12b的獲得 提取8周齡C57雄鼠附睪總RNA,反轉(zhuǎn)錄獲得相應(yīng)的cDNA。參照GenBank公布的序列(NM_203508.1),用信號肽分析軟件(http://bmbpcu36.leeds.ac.uk/prot-analysis/signal)分析出信號肽序列,將去掉信號肽的序列擴增出來。擴增目的基因的兩種片段1和2,在片段1的5端引入NdeⅠ酶切位點,在3端引入Eco RⅠ酶切位點;在片段2的5端引入Eco RⅠ酶切位點,3端引入Hin dⅢ酶切位點。其中片段1不含終止密碼子,片段2含有終止密碼子。

        設(shè)計引物如下(下劃線為酶切位點):

        1.3 表達載體的構(gòu)建及鑒定 片段1用NdeⅠ和Eco RⅠ雙酶切,片段2用Eco RⅠ和Hin dⅢ雙酶切,原核表達載體pET28(a)用Hin dⅢ、NdeⅠ雙酶切,產(chǎn)物用T4DNA連接酶連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。用Hin dⅢ和Eco R V雙酶切鑒定重組質(zhì)粒,酶切正確的質(zhì)粒由北京奧科生物技術(shù)有限責任公司測序。

        1.4 融合蛋白的誘導(dǎo)表達 將測序正確的重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta(DE3)感受態(tài)細胞,37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)過夜。次日轉(zhuǎn)接至新的液體培養(yǎng)基,振蕩培養(yǎng)至OD600nm為0.6,加入終濃度為1mmol/L的IPTG,37℃誘導(dǎo)4h。收集1mL菌液,離心去上清加入溴酚藍緩沖液懸浮沉淀,處理后進行SDS-PAGE檢驗。

        1.5 Western-blot鑒定目的蛋白 將1.4中菌體裂解液進行SDS-PAGE,轉(zhuǎn)移至0.22μm的PVDF膜上,用封閉液室溫封閉1h,以His標簽抗體孵育1h,TBST洗滌,羊抗鼠IgG-HRP孵育1h,TBST洗滌,加入HRP化學發(fā)光檢測底物后在暗室顯影。

        1.6 純化融合蛋白[12]將誘導(dǎo)成功的陽性菌液轉(zhuǎn)接至新的液體培養(yǎng)液中,37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)至OD600nm為0.6,加入IPTG誘導(dǎo),振蕩培養(yǎng)4h。離心收集菌體細胞,-20℃凍存。IPTG誘導(dǎo)前后的菌液各取1mL,SDS-PAGE檢測目的蛋白的表達。

        取出凍存的菌體,按照QIAGEN蛋白純化試劑盒說明書進行純化,向10mL變性蛋白緩沖液B(pH值8.0)中加入500μL蛋白酶抑制劑溶液,混勻后加至菌體沉淀,室溫放置1h。然后離心取上清加至Ni-NTA蛋白純化柱,用變性蛋白緩沖液C(pH值6.3)洗滌2次后用變性蛋白緩沖液E(pH值4.5)洗脫3次。收集各步驟中流出的液體,SDS-PAGE檢驗。

        2 結(jié)果

        2.1 目的基因的克隆 經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,PCR擴增產(chǎn)物約在380bp處有特異性條帶,與預(yù)期相符(圖1)。

        圖1 fam12b基因的PCR擴增結(jié)果

        2.2 重組載體的鑒定 構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)Hin dⅢ、Eco R V雙酶切鑒定,預(yù)期片段大小分別為2126bp與3969bp的片段,試驗結(jié)果與預(yù)期相符(圖2)。測序后顯示成功獲得序列完整且讀碼框正確的表達載體。

        2.3 融合蛋白的誘導(dǎo)表達及鑒定 將1.4中處理的樣品進行SDS-PAGE分析,在約31kDa處檢測到蛋白表達的條帶。Western-blot鑒定顯示出在該位置處有特異性條帶(圖3)。

        2.4 融合蛋白的親和純化 重組蛋白帶有His標簽,用Ni-NTA蛋白純化柱親和純化,收集各步驟中的液體,進行SDS-PAGE電泳檢測,如圖4。

        3 討論

        雄性哺乳動物的生殖道不容易被感染,很重要的一個原因是附睪上皮細胞會分泌一些蛋白,其中有些蛋白具有抗菌作用,保護精子可以順利通過生殖道[13],精子在穿過附睪的過程中逐步成熟[14]。我們前期的工作用fam12b的單個基因連入pET28(a)載體,摸索了不同梯度的誘導(dǎo)劑濃度和誘導(dǎo)溫度,但是均未檢測到目的蛋白的表達;只有當兩個相同的基因串聯(lián)后,才能以融合蛋白的形式表達出來,我們推測該蛋白可能具有一定的抗菌能力,兩個基因串聯(lián)表達后,改變了天然存在蛋白的空間構(gòu)象,進而干擾了蛋白的抗菌能力,故可以在大腸桿菌Rosetta中表達出來。另外,小分子蛋白的免疫原性較小,采用串聯(lián)表達的方式可以增加該蛋白的免疫原性,便于制備抗體用于后續(xù)試驗研究。

        4 結(jié)語

        本試驗利用原核表達體系表達了小鼠附睪分泌蛋白Fam12b的融合蛋白,并獲得純度較好的蛋白,為制備其多克隆抗體奠定了基礎(chǔ),為進一步研究Fam12b的功能創(chuàng)造了條件。

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