李春濤，李 超，張其中，2，楊瑩瑩，陳 霞

（1.西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 淡水生物生殖與發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 三峽庫(kù)區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室水產(chǎn)科學(xué)重慶市市級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 北碚 400715；2.暨南大學(xué)水生生物研究所，廣東 廣州 510632）

草魚(yú)（Ctenopharyngodon idellus），屬鯉科、雅羅魚(yú)亞科、草魚(yú)屬，俗稱草鯇、草根（東北），是我國(guó)著名的“四大家魚(yú)”之一，深受人們的青睞。但是在養(yǎng)殖過(guò)程中容易感染疾病。大量使用抗生素和化學(xué)藥品，在動(dòng)物體內(nèi)造成殘留，影響和惡化產(chǎn)品質(zhì)量，嚴(yán)重危害人體健康。而中藥具有天然、高效、毒副作用小、抗藥性不顯著、資源豐富以及性能多樣等優(yōu)點(diǎn)［1］。鑒于中藥以上的優(yōu)點(diǎn)，中藥在水產(chǎn)動(dòng)物疾病防治中的潛在作用引起人們廣泛關(guān)注。然而，由于目前研究的局限性，使得實(shí)際生產(chǎn)中存在忽視某些中藥毒性、盲目使用甚至亂用現(xiàn)象。因而時(shí)常發(fā)生因?qū)χ兴幍亩拘圆幻?、濃度使用不?dāng)而造成魚(yú)類中毒的情況。本試驗(yàn)在前期已篩選出具有較好促生長(zhǎng)和免疫增強(qiáng)效果的中藥免疫增強(qiáng)劑Ⅱ基礎(chǔ)上，研究了中藥免疫增強(qiáng)劑Ⅱ?qū)Σ蒴~(yú)急性毒性的影響，為草魚(yú)的健康養(yǎng)殖和病害防治提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)用魚(yú) 試驗(yàn)用二齡草魚(yú)初始體重60.15±7.78g，體質(zhì)健康，規(guī)格一致，購(gòu)于重慶北碚。

1.2 中藥免疫增強(qiáng)劑Ⅱ的制備 中藥免疫增強(qiáng)劑Ⅱ由黃芪、大蒜、菊花、山楂和板藍(lán)根、蘆薈、白術(shù)、金銀花、當(dāng)歸、桑枝10種中藥按等比組成，中藥購(gòu)于重慶北碚心連心大藥房。先加自來(lái)水浸泡30min，再煮沸20min，最后文火煎熬30min，藥物經(jīng)3次煎熬、合并、濃縮到所需要體積（40mL），制成1mL相當(dāng)于原中藥2.5g。

1.3 飼養(yǎng)管理 試驗(yàn)用魚(yú)飼養(yǎng)在玻璃缸（0.54m×0.26m×0.45m）里。試驗(yàn)開(kāi)始前用基礎(chǔ)飼料馴養(yǎng)草魚(yú)7d，以適應(yīng)環(huán)境和試驗(yàn)飼料。試驗(yàn)開(kāi)始后，除每日正常投喂飼料外，8：00開(kāi)始灌喂中藥免疫增強(qiáng)劑Ⅱ1mL／尾，每天1次。玻璃缸24h不間斷充氣。養(yǎng)殖期間水溫為22℃～24℃，pH值為7.6±0.5，溶解氧為6.7～7.4mg／L。

1.4 試驗(yàn)方法 在初次預(yù)試驗(yàn)中，將150尾草魚(yú)隨機(jī)分成5組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10尾，組間魚(yú)體重量無(wú)顯著差異（P＞0.05）。以10倍之差確定5個(gè)濃度（2.5g／mL、0.25g／mL、0.025g／mL、0.0025g／mL、0.00025g／mL），試驗(yàn)處理96h.經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)，并逐步縮小濃度范圍，最后找出100%致死濃度（g／mL）與最大耐受濃度（g／mL），并根據(jù)等對(duì)比間距法［2］確定各試驗(yàn)組濃度（具體方法：r=n-式中r為相鄰兩個(gè)劑量比值；b為最高劑量；a為最低劑量；n為劑量組數(shù)）。

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果確定試驗(yàn)濃度范圍。按等對(duì)數(shù)間距設(shè)置5個(gè)濃度組及1個(gè)對(duì)照組，每個(gè)組設(shè)3個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)藥物采取先配制最高濃度，再按要求采取逐級(jí)稀釋方法配制成各試驗(yàn)組所需濃度藥液。試驗(yàn)藥物現(xiàn)配現(xiàn)用，從低濃度到高濃度逐級(jí)口灌。試驗(yàn)期間每天口灌1次。試驗(yàn)開(kāi)始的24h，持續(xù)觀察記錄草魚(yú)的活動(dòng)情況，然后分別于24h、48h、96h時(shí)記錄草魚(yú)的活動(dòng)和存活情況。判斷魚(yú)死亡的方法是當(dāng)魚(yú)中毒停止呼吸后，用小鑷子夾魚(yú)的尾柄部，5 min內(nèi)不出現(xiàn)反應(yīng)可判定為死亡［3］。

1.5 計(jì)算方法 采用Karber法［4］計(jì)算半致死濃度LC50計(jì)算公式：

式中XM為死亡組最大劑量的常用對(duì)數(shù)；d為相鄰組濃度常用對(duì)數(shù)差；p為各組的死亡率；∑p為各組死亡率的總和。

安全濃度計(jì)算公式：

2 試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)各個(gè)試驗(yàn)組的死亡情況研究中藥免疫增強(qiáng)劑Ⅱ?qū)Σ蒴~(yú)的毒性影響，結(jié)果見(jiàn)表1：各試驗(yàn)組在24、48、96h死亡率均為0。根據(jù)公式無(wú)法計(jì)算其半致死濃度和安全濃度，但24hLC50一定大于2.5 g／mL。

表1 中藥免疫增強(qiáng)劑Ⅱ?qū)Σ蒴~(yú)的死亡率、半致死濃度和安全濃度

3 討論

藥物對(duì)試驗(yàn)魚(yú)的毒性大小可用半致死濃度（LC50）衡量。LC50越小，毒性越強(qiáng)。本中藥免疫增強(qiáng)劑Ⅱ在制備時(shí)，其水提取物從最小濃度為0.00025g／mL（成液態(tài)）到最大濃度為2.5g／mL（成膠狀）之間，在96h周期中均未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。依據(jù)LC50值的大小，可以將化學(xué)物質(zhì)的急性毒性分為劇毒、高毒、中等毒、低毒和微毒5級(jí)［5］，如表2所示。

表2 有毒物質(zhì)對(duì)魚(yú)類的毒性標(biāo)準(zhǔn)

經(jīng)換算其24hLC50大于～mg／L，表明本試驗(yàn)采用的中藥免疫增強(qiáng)劑Ⅱ?qū)Σ蒴~(yú)的毒性為微毒或者無(wú)毒，且對(duì)草魚(yú)有良好的抗病促生長(zhǎng)效果，可作為一種新型的綠色飼料添加劑，在魚(yú)類養(yǎng)殖業(yè)中具有應(yīng)用價(jià)值。

［1］王吉橋，孫永新，張劍誠(chéng).金銀花等復(fù)方草藥對(duì)牙鲆生長(zhǎng)、消化和免疫能力的影響［J］.水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2006，30（1）：90-96.

［2］沈建忠.動(dòng)物毒理學(xué)［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2004：83-87.

［3］朱蓓蕾.動(dòng)物毒理學(xué)［M］.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1989：37-40.

［4］楊治國(guó)，楊東輝，葉新太.八種藥物對(duì)瓦氏黃顙魚(yú)種的急性毒性［J］.中國(guó)水產(chǎn)，2002（3）：59-61.

［5］盧玲，宋福.魚(yú)類急性毒性實(shí)驗(yàn)［J］.生物學(xué)通報(bào)，2002，37（7）：52-53.