高光平,張艷英,高桂生,湯生玲,史秋梅,梁銀聚,邵欣華

(1.河北科技師范學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 昌黎 066600;2.河北新華科極獸藥有限公司,河北 石家莊 051430)

大腸桿菌是禽類常見的腸道條件致病菌。中草藥在我國(guó)資源豐富,價(jià)格低廉,相對(duì)于抗生素和化學(xué)合成藥物而言,含有多種藥效成分,具有多靶點(diǎn)、毒性較低、不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn),在防病治病的同時(shí),還具有促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、提高整體抗病能力等作用,且使用后也不會(huì)影響禽產(chǎn)品的食用安全性與食用品質(zhì),符合當(dāng)今社會(huì)倡導(dǎo)的綠色養(yǎng)殖主題,有著廣闊的發(fā)展前景。

近年來,有關(guān)中藥抗大腸桿菌病的作用研究有許多報(bào)道[1-2]。但是應(yīng)用藥物敏感性試驗(yàn)和最小抑菌濃度兩種方法綜合評(píng)價(jià)中藥口服液對(duì)大腸桿菌的體外抑制作用較少見于報(bào)道。本次試驗(yàn)通過藥物的敏感性和最小抑菌濃度對(duì)中藥口服液體外抑制大腸桿菌O78的效果進(jìn)行了初步的探究,二者綜合判斷其抑菌效果,為臨床用藥打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種 雞源性大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌種(O78)購自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 藥品 大青止瀉口服液:由大青葉、黃柏、烏梅、訶子組成;白頭翁口服液:由白頭翁、黃連、大黃、甘草組成;雙連固腸口服液:由金銀花、穿心蓮、黃芪、秦皮組成。以上中藥均購自昌黎縣民生藥店。藥敏紙片購自北京天壇生物藥物技術(shù)開發(fā)公司:頭孢他啶(30μg,0903061),頭孢吡肟(30 μg,0908221),頭孢曲松(30μg,0811261),頭孢噻肟(30μg,0812171),丁胺卡那霉素(30μg,0902201),氟哌酸(10μg,0903181),環(huán)丙沙星(5μg,0902271),慶大霉素(10 μg,0902181),克林霉素(2 μg,0902251)。

1.3 試劑 營(yíng)養(yǎng)瓊脂,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(0906251);營(yíng)養(yǎng)肉湯,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(0901061)。

1.4 試驗(yàn)儀器 高壓蒸汽滅菌鍋、中藥煎藥機(jī)、恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器等。

1.5 中藥口服液的制備 將3種方劑的中藥分別混勻后,裝入無紡布袋,清水浸泡30 min,加熱煮沸30 min,過濾,藥渣再加清水煮沸20 min,過濾,合并二次濾液后濃縮至生藥含量1 g/m L,121℃滅菌20 min,4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 菌種準(zhǔn)備 將試驗(yàn)菌種接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板,37℃培養(yǎng)18 h,然后挑取普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上的純培養(yǎng)典型菌落于3 m L生理鹽水中,混勻后與菌液比濁管比濁,調(diào)整濁度與比濁管(0.5麥?zhǔn)蠁挝?相同。

1.7 藥物敏感性試驗(yàn)

1.7.1 打孔法 于無菌平皿內(nèi)加入約25 m L營(yíng)養(yǎng)瓊脂,凝固后用無菌棉拭子蘸取已配制好的細(xì)菌混懸液涂布整個(gè)營(yíng)養(yǎng)瓊脂表面。用直徑為0.6 cm的無菌打孔器在培養(yǎng)基上打孔,在孔內(nèi)加入1 g/mL生藥的口服液,以加滿而不溢出孔外為宜。每種藥液做3個(gè)平皿,置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,測(cè)量抑菌圈直徑。判定標(biāo)準(zhǔn):抑菌圈直徑＜8 mm,為不敏感,記為(-);抑菌圈直徑8～13 mm之間,為低度敏感,記為(+);抑菌圈直徑在13～19 mm之間,為中度敏感,記為(++);抑菌圈直徑在＞19 mm,為高度敏感,記為(+++)[3]。

1.7.2 K-B紙片法 于無菌平皿內(nèi)加入約25 mL營(yíng)養(yǎng)瓊脂,凝固后用無菌棉拭子蘸取已配制好的細(xì)菌混懸液涂布整個(gè)營(yíng)養(yǎng)瓊脂表面取藥敏紙片貼在平板表面,置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,測(cè)量抑菌圈的直徑。判定標(biāo)準(zhǔn)采用美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS)推薦的判斷標(biāo)準(zhǔn)表示[4]。

1.8 藥物的最小抑菌濃度(MIC)試驗(yàn) 管碟法:取13×100 mm滅菌試管11支,編號(hào),每管加入無菌肉湯培養(yǎng)基2 m L,然后于第1管中加入受試中藥口服液2 m L,混勻后取出2 m L加入第2管中,以此類推,直到第9管中取出2 m L棄去,第10管不加藥液作陽性對(duì)照,第11管加入受試藥液2 mL,混勻后取2 mL棄去,不加細(xì)菌作陰性對(duì)照。將培養(yǎng)8 h的試驗(yàn)菌液,用無菌肉湯稀釋成原溶液的10-3倍濃度,分別取 0.1 mL加入上述1～10號(hào)試管中[5]。從上述11個(gè)試管中分別取1 m L液體加入11個(gè)滅菌的平皿中,將滅菌處理的冷卻至40℃的營(yíng)養(yǎng)瓊脂分別倒入上述11個(gè)平皿中,晃動(dòng)平皿使之混合均勻,瓊脂凝固后放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,觀察平皿中菌落數(shù)量,試驗(yàn)重復(fù)3次,以無菌落生長(zhǎng)平板的最低藥物濃度為最小抑菌濃度(minimum inhibiting concentrations,MIC)[6-7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果 大青止瀉口服液、白頭翁口服液、雙連固腸口服液對(duì)大腸桿菌O78均有較好的抑制作用,其中大青止瀉口服液抑菌效果最強(qiáng);白頭翁口服抑菌效果較弱;西藥對(duì)照組中,大腸桿菌O78對(duì)丁胺卡那霉素、氟哌酸、頭孢類抗生素高度敏感;對(duì)環(huán)丙沙星、慶大霉素、克林霉素耐藥。藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表1。

2.2 藥物MIC試驗(yàn)結(jié)果 大青止瀉口服液的MIC為0.031 g/mL(1∶32),白頭翁口服液的MIC為0.25 g/mL(1∶4),雙連固腸口服液的 MIC為0.063 g/mL(1∶16)。藥物MIC測(cè)定結(jié)果見表2。

表1 藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

表2 藥物MIC測(cè)定結(jié)果

3 討論

在測(cè)定MIC時(shí),本試驗(yàn)采用了管碟法。由于中草藥是有顏色的,因此,本試驗(yàn)中所設(shè)陰性對(duì)照并非常規(guī)的培養(yǎng)基對(duì)照而是含有藥液的培養(yǎng)基,并且采用瓊脂平板計(jì)數(shù),以消除上述不利因素,確保了結(jié)果判定的準(zhǔn)確性。劉玉慶等在測(cè)定MIC時(shí),采用了平板稀釋法[2],簡(jiǎn)化了試驗(yàn)操作,但這種方法不能最大限度提高中藥濃度,對(duì)于高M(jìn)IC中藥測(cè)定不利;管碟法結(jié)合了試管法濃度高、準(zhǔn)確性好及平板法顯示穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn),比較適合中藥MIC的測(cè)定。Seishi Matsumura等在測(cè)定黃芩對(duì)致齲細(xì)菌的最小抑菌濃度時(shí),也同樣采用了管碟法,效果良好[8]。

4 結(jié)語

4.1 藥物敏感性試驗(yàn)表明,自擬的大青止瀉口服液、白頭翁口服液、雙連固腸口服液對(duì)大腸桿菌O78均具有較好的抑菌作用,且大青止瀉口服液和雙連固腸口服液的抑菌效果較白頭翁口服液好。自擬的口服液雖然比頭孢菌素類的抑菌效果弱,但是比慶大霉素、克林霉素、環(huán)丙沙星的抑菌效果好。

4.2 3種方劑的MIC試驗(yàn)結(jié)果表明,大腸桿菌O78對(duì)大青止瀉口服液和雙連固腸口服液更敏感,大青止瀉口服液的最小抑菌濃度是0.031 g/m L,白頭翁口服液和雙連固腸口服液的最小抑菌濃度分別是0.25 g/m L,0.063 g/m L。

3種方劑的藥物敏感性結(jié)果與MIC試驗(yàn)結(jié)果一致。綜上所述,3種方劑對(duì)大腸桿菌O78均有較好的體外抑制作用,其中大青止瀉口服液效果最佳,雙連固腸口服液次之。

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