武桂梅,王振輝,張桂榮,劉 軍

(1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,吉林吉林132101;2.吉林正業(yè)生物制品股份有限公司,吉林 吉林 132101)

目前,用于預(yù)防畜禽傳染病的疫苗都是沒(méi)有純化的。疫苗中含有大量的制苗材料來(lái)源的蛋白質(zhì)及抗生素,無(wú)疑是接種動(dòng)物的各種不良反應(yīng)的過(guò)敏原,嚴(yán)重干擾疫苗蛋白抗原的免疫應(yīng)答,大大減少中和抗體的產(chǎn)生,導(dǎo)致一些畜禽個(gè)體免疫失敗[1]。本試驗(yàn)采用膜分離技術(shù)對(duì)豬瘟病毒的純化濃縮,顯著提高了免疫效果。

1 材料與方法

1.1 微濾/超濾管式陶瓷(有機(jī))膜分離系統(tǒng)(型號(hào):S Y-MU-2-500) 管式陶瓷膜元件孔徑0.80μm、0.60 μm、0.45μm、0.22 μm;管式有機(jī)膜元件(改良纖維素)5K由本院生物制藥實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 豬瘟疫苗病毒細(xì)胞培養(yǎng)液 吉林正業(yè)生物制品股份有限公司提供90000 m L效力檢驗(yàn)不合格(病毒最小感染量≥10-4/mL)的豬瘟細(xì)胞培養(yǎng)液及合格的常規(guī)豬瘟凍干活疫苗(500頭份,批號(hào)20080109)。

1.3 試劑與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所生產(chǎn)的豬瘟陽(yáng)性血清(批號(hào)20080206)、豬瘟陰性血清(批號(hào)20080110)、豬瘟正向間接血凝診斷液(批號(hào)20080309)、豬瘟病毒脾淋毒(最小感染量≤10-5/m L)均由吉林正業(yè)生物制品股份有限公司提供。仔豬由吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院種豬場(chǎng)提供;健康家兔、小鼠、豚鼠由吉林正業(yè)生物制品股份有限公司健康動(dòng)物舍提供。

1.4 不同膜組合對(duì)豬瘟病毒液的純化與濃縮[2]每組膜純化濃縮處理30000 mL不合格的豬瘟病毒細(xì)胞培養(yǎng)液,分三組進(jìn)行:1組(0.80μm、5K、0.22 μm)陶瓷(有機(jī))膜過(guò)濾器;2組(0.60μm、5K 、0.22 μm)陶瓷(有機(jī))膜過(guò)濾器;3組(0.45μm、5K 、0.22 μm)陶瓷(有機(jī))膜過(guò)濾器。先分別用0.80μm、0.60μm、0.45μm 陶瓷膜過(guò)濾雜蛋白,再用5K有機(jī)膜濃縮病毒,最后用0.22μm陶瓷膜除菌處理。

1.5 雜蛋白去除率與無(wú)菌檢驗(yàn)[2-3]三組純化的豬瘟病毒液分別用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)雜蛋白去除率;分別用硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(T.G)、酪胨瓊脂培養(yǎng)基(G.A)、葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基(G.P)按文獻(xiàn)中的方法進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)。

1.6 純化濃縮的豬瘟病毒液效力檢驗(yàn)[3-4]三組純化的豬瘟病毒液分別稀釋為10-4、10-5、10-6三個(gè)滴度,每個(gè)滴度分別用3.0 kg左右的健康家兔2只,每只家兔耳靜脈注射1 m L。家兔接種后,每天上下午各測(cè)體溫1次,48～96 h后,每隔6 h測(cè)體溫1次,根據(jù)體溫反應(yīng)和無(wú)體溫反應(yīng)兔攻擊豬瘟病毒脾淋毒后的體溫測(cè)定結(jié)果,判定純化濃縮的各組豬瘟病毒液的最小感染量。

1.7 純化濃縮的豬瘟病毒液安全檢驗(yàn)[3-4]三組純化的豬瘟病毒液分別進(jìn)行10倍稀釋,分別皮下注射體重 18～22 g小鼠各5只,每只0.2 mL;肌肉注射體重350～ 400 g豚鼠各2只,每只1 m L,均觀察10 d;肌肉注射無(wú)豬瘟母原抗體10 kg左右的仔豬各4頭,每頭5 m L,飼養(yǎng)觀察21 d,同時(shí)設(shè)同批對(duì)照小鼠5只、豚鼠2只、仔豬 4頭,按要求飼養(yǎng)在非免疫區(qū),判定結(jié)果。

1.8 純化濃縮的豬瘟凍干活疫苗成品檢驗(yàn) 分別將三組純化濃縮合格的豬瘟病毒液添加常規(guī)的豬瘟凍干活疫苗保護(hù)劑,按照豬瘟疫苗凍干曲線進(jìn)行凍干制造成品。其成品的無(wú)菌檢驗(yàn)、效力檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)分別按1.5、1.6、1.7項(xiàng)進(jìn)行。

1.9 純化濃縮的豬瘟凍干活疫苗成品免疫試驗(yàn)

1.9.1 仔豬分組與免疫[5-6]根據(jù)試驗(yàn)內(nèi)容,選用28日齡斷奶前仔豬80頭(母原抗體平均≤4log2),隨機(jī)平均分為4組。第 1、2、3組每頭仔豬對(duì)應(yīng)接種三組純化濃縮的豬瘟凍干活疫苗1.0頭份;第4組為常規(guī)疫苗免疫對(duì)照組,每頭仔豬接種常規(guī)豬瘟活疫苗1.0頭份,四組免疫仔豬均在相同條件下飼養(yǎng)90 d監(jiān)測(cè)抗體消長(zhǎng)規(guī)律。

1.9.2 抗體測(cè)定[7-8]分別于免疫后第0、7、14、21 、28、35、42、49、56、63、70、77 、84 天對(duì) 4 組試驗(yàn)豬耳靜脈采血,分離血清,用豬瘟正向間接凝集診斷試劑盒測(cè)定豬瘟抗體。每組試驗(yàn)豬的抗體效價(jià)均以各自的幾何平均值表示。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 雜蛋白去除率與無(wú)菌檢驗(yàn)結(jié)果 1組的陶瓷膜是0.80μm,孔徑最大,只有大分子雜蛋白被截留除去,所以雜蛋白去除率較低,為63.1%,濃縮除菌收獲量最多為10800 m L;3組的陶瓷膜是 0.45 μm,孔徑最小,多數(shù)雜蛋白被截留除去,所以雜蛋白去除率最高,為79.4%,但濃縮除菌收獲量最少,為4700 mL;2組純化效果介于1組和3組之間。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 豬瘟疫苗病毒液純化濃縮雜蛋白去除率與無(wú)菌檢驗(yàn)結(jié)果

2.2 純化濃縮的豬瘟病毒液凍干前后效力檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)結(jié)果 3組凍干疫苗由于純化濃縮平均去除雜蛋白達(dá)到71.27%,大大減少雜蛋白對(duì)最小感染量和安全檢驗(yàn)的影響,達(dá)到檢驗(yàn)一次通過(guò)率,全部合格。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3 純化濃縮的豬瘟凍干活疫苗成品免疫抗體檢測(cè)結(jié)果 通過(guò)純化濃縮的凍干活疫苗的免疫和常規(guī)疫苗免疫對(duì)照試驗(yàn)檢測(cè)的數(shù)據(jù),繪制出抗體消長(zhǎng)曲線,結(jié)果見(jiàn)圖1。3組純化濃縮的凍干活疫苗免疫28 d時(shí):1組抗體平均升至最高,為8.3log2稀釋倍數(shù),平均抗體升高為5.9log2稀釋倍數(shù);2組抗體平均升至最高,為8.7log2稀釋倍數(shù),平均抗體升高為6.6log2稀釋倍數(shù);3組抗體平均升至最高為9.3log2稀釋倍數(shù),平均抗體升高為7.2log2稀釋倍數(shù);而常規(guī)的弱毒凍干活疫苗抗體平均升至最高為6.8log2稀釋倍數(shù),平均抗體升高為4.8log2稀釋倍數(shù)。免疫至84 d時(shí),三組純化凍干疫苗平均抗體增加8.8log2稀釋倍數(shù),比普通豬瘟疫苗平均抗體增加3.9log2稀釋倍數(shù),差異極顯著(P＜0.01)。免疫63～84 d時(shí),三組純化凍干疫苗抗體滴度仍然高于免疫前水平,而普通常規(guī)的凍干疫苗抗體滴度顯著下降到免疫前水平。

表2 純化濃縮的豬瘟疫苗病毒液凍干前后效力檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)結(jié)果

圖1 抗體消長(zhǎng)曲線

3 討論

本試驗(yàn)采用不同孔徑的微孔濾膜及不同分子量截留值的超濾膜組件,可連續(xù)進(jìn)行雜蛋白的去除純化、濃縮、除菌操作。而結(jié)構(gòu)完整的豬瘟病毒[9]粒子粒徑大小為34～50 nm,正好介于所選陶瓷(有機(jī))膜孔徑之間。由結(jié)果證明:1組的0.80μm陶瓷膜濾除雜蛋白效果最差,為63.1%,免疫效果比2、3組差,但比常規(guī)苗好;2組的0.60μm陶瓷膜濾除雜蛋白效果較好,為71.3%,免疫效果介于1、3組之間;三組的0.45μm陶瓷膜濾除雜蛋白效果最好,為79.4%,免疫效果最好。

陶瓷(有機(jī))膜純化與濃縮工藝可將效價(jià)不合格的豬瘟病毒培養(yǎng)液變成合格的疫苗,提高了疫苗的產(chǎn)量與經(jīng)濟(jì)效益,而且純化濃縮的凍干活疫苗免疫效果顯著高于常規(guī)的凍干活疫苗免疫效果。從圖1的抗體曲線明顯看出,三組純化的凍干活疫苗免疫抗體效價(jià)上升快,抗體消長(zhǎng)時(shí)間比普通常規(guī)的疫苗免疫抗體延長(zhǎng)達(dá)3周左右,其中3組抗體消長(zhǎng)效果最好,因?yàn)樗募兌茸罡?1組抗體消長(zhǎng)比2組、3組稍差,這說(shuō)明疫苗的雜蛋白的含量干擾免疫抗體的消長(zhǎng)變化。而常規(guī)的疫苗抗體消長(zhǎng)效果大大低于三組純化的疫苗免疫效果,充分證明雜蛋白的含量對(duì)免疫的影響。

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