張志才，陳明霞，李 欣，申王莉

（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

靈芝 （Ganoderma lucidum）是一種珍貴的藥 （食）用真菌，具有較高的藥用價(jià)值。近年來，藥用真菌與中藥結(jié)合發(fā)酵已經(jīng)成為開發(fā)藥用資源的一種非常有效的途徑。一方面中藥中的某些成分可以促進(jìn)靈芝自身某些活性成分的產(chǎn)生或者增強(qiáng)；另一方面靈芝也可以利用中藥的一些活性成分轉(zhuǎn)化成自身有效成分[1－3]。目前針對添加中藥對靈芝液體深層發(fā)酵的研究報(bào)道很多，添加中藥的方法主要有3種：按照一定的比例添加中藥粉末[3－6]，研究發(fā)現(xiàn)一些中藥對菌絲體生物量、胞外多糖含量及靈芝酸含量有一定促進(jìn)作用；在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中加入一定量中藥水提取液[7－11]，同添加中藥粉末的作用類似，另外還發(fā)現(xiàn)添加中藥水提取液菌絲體體外清除自由基活性有一定增強(qiáng)；添加中藥有機(jī)化學(xué)試劑提取液，有報(bào)導(dǎo)加入一定量薏苡仁油可促進(jìn)靈芝菌絲體的生長及胞外多糖的生產(chǎn)[12]。這些試驗(yàn)結(jié)果證明某些中藥可以增加靈芝液體培養(yǎng)的生物量、胞外多糖、靈芝酸的含量[3－12]。而中藥對固體栽培子實(shí)體成分影響的報(bào)道少有報(bào)道。盡管椴木栽培的靈芝干燥后靈芝質(zhì)地厚實(shí)、堅(jiān)硬、營養(yǎng)及藥效成分齊全，但是其操作復(fù)雜、成本高、生長周期長，不利用大規(guī)模開發(fā)利用[13]。因此本課題探討添加中藥對靈芝子實(shí)體固體栽培下子實(shí)體成分的變化，目的是獲得藥理作用良好、人工栽培期短暫的靈芝子實(shí)體，為更好的發(fā)揮靈芝子實(shí)體輔助治療的效果奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑

赤芝菌種，南通安惠生物科技有限公司惠贈；中藥（干姜、青蒿、黃連、苦參、槐米花、何首烏、葛根、山藥），購于鎮(zhèn)江存仁堂醫(yī)藥連鎖有限責(zé)任公司夢溪藥店；蘆丁、齊墩果酸、人參皂甙Rb1均為生化試劑，購于南京替斯艾么中藥研究所；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 培養(yǎng)方法

斜面種子菌：制作PDA培養(yǎng)基，在無菌操作環(huán)境下，斜面種子菌每6個(gè)月轉(zhuǎn)接1次，以保持菌種活力。

靈芝原種制作：麥麩與水按照1∶1比例混勻，按照每瓶35 g上述混合培養(yǎng)基分裝到250 mL三角瓶，利用棉塞封口，pH自然，然后在1.0 kPa壓力滅菌1 h，冷卻至室溫，在無菌操作環(huán)境下，接入靈芝試管斜面菌種，于30℃培養(yǎng)2.5 d。

靈芝液體發(fā)酵：去皮土豆600 g切成小塊，加入水3000 mL，煮沸30 min，利用兩層紗布過濾并取清液，加入60 g葡萄糖，定容至3000 mL。按照每瓶100 mL上述液體培養(yǎng)基分裝到250 mL三角瓶，在1.0 kPa壓力滅菌30 min，冷卻至室溫，在無菌操作環(huán)境下，接入靈芝原種，30℃下培養(yǎng)4 d，作為菌種。在以上100 mL培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，分別按照2‰、5‰、8‰添加中藥，以不添加中藥作為對照，于1.0 kPa壓力滅菌30 min，冷卻到室溫后，在無菌操作環(huán)境下，接入液體搖瓶菌種，30℃下培養(yǎng)7 d。用2層紗布過濾發(fā)酵液，取菌絲球于80℃烘箱中烘干至恒重。根據(jù)此處菌絲球生物量高低確定靈芝子實(shí)體栽培中添加中藥的比重。

靈芝栽培管理：麥草粉、麥麩和水按照4∶1∶10的比例混勻，分成9組，每組6瓶，分別添加2‰生姜、青蒿、黃連，5‰苦參、槐米花，8‰何首烏、葛根、山藥，以不添加中藥作為對照，按照每瓶105 g分裝到500 mL三角瓶，料面中央鉆1個(gè)直徑1 cm～2 cm的孔，孔深至瓶底，擦干靜瓶口，棉塞封口，用2層報(bào)紙包封瓶頭，1.0 kPa壓力滅菌1 h，冷卻至室溫。在無菌操作環(huán)境下，接入靈芝原種，然后在30℃下培養(yǎng)30 d。待菌絲長滿瓶，將三角瓶移入栽培室，直接放置于地面，控制空氣濕度在80%～90%。當(dāng)瓶內(nèi)靈芝子實(shí)體長至棉塞時(shí)，拔掉棉塞，讓子實(shí)體順利生長。整個(gè)生長階段控制光照強(qiáng)度為100 lx左右。當(dāng)子實(shí)體長至直徑5 cm～7 cm時(shí)采集子實(shí)體，并于80℃烘箱中烘干至恒重，備用。

1.3 子實(shí)體成分提取

將赤芝子實(shí)體6個(gè)重復(fù)樣分別用粉碎機(jī)粉碎，取1 g粉碎粉末加入10 mL無水乙醇，置于25 mL試管，用保鮮膜封口并于80℃水浴提取6 h，上清液經(jīng)無水乙醇稀釋5倍并在4℃冰柜中冷藏用于分析總黃酮、總靈芝三帖和總皂甙的含量；殘?jiān)?0 mL水于80℃水浴提取6 h，取上清液，用于分析靈芝多糖的含量。

1.4 成分分析

1.4.1 多糖測定

采用苯酚硫酸法并作修改[14]。

1.4.2 黃酮測定

亞硝酸鈉－硝酸鋁法[15]。

1.4.3 三萜類測定

取1.3中無水乙醇上清液試樣1 mL，加入1 mL鹽酸密封于沸水浴水解6 h。采用王翔飛等描述的方法測定[16]。

1.4.4 皂甙測定

采用Pan Shu－yi描述的方法測定[17]，并加以修改。精密稱取上述人參皂甙標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL，分別置于試管中，各加無水乙醇至1 mL，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的香草醛冰乙酸溶液0.2 mL和0.8 mL高氯酸，于60℃水浴15 min，流動水冷卻，再加入3 mL冰乙酸，搖勻后置于室溫，在570 nm處測定吸光度值，并制作空白液作空白對照。以濃度－吸光度值做標(biāo)準(zhǔn)曲線。試樣測定方法取1 ml.3中無水乙醇上清稀釋液，依次加入上述試劑，并570 nm測定吸光度、計(jì)算含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 液體發(fā)酵生物量

靈芝液體發(fā)酵菌絲體生物量情況見表1。

表1 靈芝液體發(fā)酵菌絲體生物量

根據(jù)表1中菌絲球生物量，并且相互之間生物量差距不超過 0.2 g·100－1·mL－1， 以高劑量為依據(jù)確定幾種中藥的添加量，2‰干姜、青蒿、黃連，5‰苦參、槐米花，8‰何首烏、葛根、山藥。

2.2 成分分析

2.2.1 黃酮含量

許多文獻(xiàn)報(bào)道真菌在液體培養(yǎng)時(shí)具有富集轉(zhuǎn)化中藥的活性成分的功能，實(shí)驗(yàn)首先考察了靈芝子實(shí)體是否具有這方面的功能。在選用的藥材中都含有黃酮，但是不同的中藥材黃酮的含量不同，而未見靈芝的子實(shí)體含有黃酮的報(bào)道，因此試驗(yàn)首先以黃酮為指標(biāo)考察了靈芝子實(shí)體富集植物中的活性成分的能力，結(jié)果見圖1。

圖1 靈芝子實(shí)體中黃酮含量

圖1顯示添加中藥的靈芝子實(shí)體中都含有黃酮，而未添加中藥靈芝子實(shí)體 （對照）的未檢出黃酮，與對照相比，添加中藥后，靈芝子實(shí)體中黃酮含量顯著增加 （p＜0.05）。其中添加葛根、苦參和干姜培養(yǎng)的子實(shí)體中黃酮含量最高，同時(shí)添加其余幾種中藥的黃酮含量較低，說明靈芝具有富集植物中活性成分能力，盡管槐米花中黃酮含量比葛根、苦參和干姜高，但靈芝對槐米花中黃酮富集能力較差，說明靈芝對同一類成分不同組分富集能力不同。

2.2.2 多糖含量

多糖是靈芝的主要活性成分之一，大量文獻(xiàn)報(bào)道靈芝液體發(fā)酵菌絲體及子實(shí)體中含有豐富的多糖，并且在液體深層發(fā)酵菌絲中，添加適量一定種類的中藥對多糖的富集有一定促進(jìn)作用，因此試驗(yàn)考察了中藥對靈芝子實(shí)體多糖含量影響，結(jié)果見圖2。

圖2 靈芝子實(shí)體中多糖含量

圖2中除葛根在添加8‰的量下對固體栽培子實(shí)體中多糖含量沒有增強(qiáng)作用。其他7種中藥均顯著增加了靈芝子實(shí)體多糖的含量 （p<0.05），尤其以添加黃連和苦參，子實(shí)體多糖含量增加最為明顯。該結(jié)果說明不同的中藥對子實(shí)體多糖影響不同。

2.2.3 三萜含量

三萜類化合物是靈芝赤子實(shí)體中的另一類主要活性成分三萜類含量如圖3中所示。

圖3 靈芝子實(shí)體中三萜含量

從圖3中可以觀察到培養(yǎng)基中添加槐米花、苦參、黃連、山藥、干姜、葛根6種中藥有增加子實(shí)體中三萜含量，尤其以槐米花和苦參增加幅度較大。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，與空白組作對比，只有苦參對子實(shí)體三萜含量具有顯著性影響 （p<0.05）。

2.2.4 皂甙含量

常見的有葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖及葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸等，常與皂甙元C3位的-OH連接成甙。皂甙可以分為三萜皂甙與甾體皂甙兩大類，發(fā)酵培養(yǎng)子實(shí)體皂甙含量如圖4所示。

圖4 靈芝子實(shí)體中皂甙的含量

由圖4可以看出，實(shí)驗(yàn)中添加的8種中藥均對子實(shí)體皂甙成分的富集有促進(jìn)作用，其中槐米花的促進(jìn)作用最為明顯。同時(shí)添加中藥發(fā)酵子實(shí)體中皂甙含量依次為：槐米花＞山藥＞干姜＞苦參＞黃連＞葛根＞青蒿＞何首烏，并且差距非常明顯。根據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，與對照組比較，表明槐米花、山藥、干姜、苦參4種中藥對靈芝字體皂甙含量的具有顯著的促進(jìn)作用 （p<0.05）。

2.3 結(jié)論

靈芝子實(shí)體具有富集植物中活性成分的作用，同時(shí)植物中活性成分也有促進(jìn)靈芝子實(shí)體中活性成分合成的作用，靈芝對不同的中藥以及同一類化合物不同的組分作用效果不同，同樣的不同中藥以及同一類中藥的不同的組分對靈芝子實(shí)體組分作用效果也不同。

添加中藥強(qiáng)化子實(shí)體有效成分的研究有待進(jìn)一步深入研究。

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