張志才，陳明霞，李 欣，申王莉

（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

靈芝 （Ganoderma lucidum）是一種珍貴的藥 （食）用真菌，具有較高的藥用價值。近年來，藥用真菌與中藥結(jié)合發(fā)酵已經(jīng)成為開發(fā)藥用資源的一種非常有效的途徑。一方面中藥中的某些成分可以促進靈芝自身某些活性成分的產(chǎn)生或者增強；另一方面靈芝也可以利用中藥的一些活性成分轉(zhuǎn)化成自身有效成分[1－3]。目前針對添加中藥對靈芝液體深層發(fā)酵的研究報道很多，添加中藥的方法主要有3種：按照一定的比例添加中藥粉末[3－6]，研究發(fā)現(xiàn)一些中藥對菌絲體生物量、胞外多糖含量及靈芝酸含量有一定促進作用；在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中加入一定量中藥水提取液[7－11]，同添加中藥粉末的作用類似，另外還發(fā)現(xiàn)添加中藥水提取液菌絲體體外清除自由基活性有一定增強；添加中藥有機化學(xué)試劑提取液，有報導(dǎo)加入一定量薏苡仁油可促進靈芝菌絲體的生長及胞外多糖的生產(chǎn)[12]。這些試驗結(jié)果證明某些中藥可以增加靈芝液體培養(yǎng)的生物量、胞外多糖、靈芝酸的含量[3－12]。而中藥對固體栽培子實體成分影響的報道少有報道。盡管椴木栽培的靈芝干燥后靈芝質(zhì)地厚實、堅硬、營養(yǎng)及藥效成分齊全，但是其操作復(fù)雜、成本高、生長周期長，不利用大規(guī)模開發(fā)利用[13]。因此本課題探討添加中藥對靈芝子實體固體栽培下子實體成分的變化，目的是獲得藥理作用良好、人工栽培期短暫的靈芝子實體，為更好的發(fā)揮靈芝子實體輔助治療的效果奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑

赤芝菌種，南通安惠生物科技有限公司惠贈；中藥（干姜、青蒿、黃連、苦參、槐米花、何首烏、葛根、山藥），購于鎮(zhèn)江存仁堂醫(yī)藥連鎖有限責(zé)任公司夢溪藥店；蘆丁、齊墩果酸、人參皂甙Rb1均為生化試劑，購于南京替斯艾么中藥研究所；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 培養(yǎng)方法

斜面種子菌：制作PDA培養(yǎng)基，在無菌操作環(huán)境下，斜面種子菌每6個月轉(zhuǎn)接1次，以保持菌種活力。

靈芝原種制作：麥麩與水按照1∶1比例混勻，按照每瓶35 g上述混合培養(yǎng)基分裝到250 mL三角瓶，利用棉塞封口，pH自然，然后在1.0 kPa壓力滅菌1 h，冷卻至室溫，在無菌操作環(huán)境下，接入靈芝試管斜面菌種，于30℃培養(yǎng)2.5 d。

靈芝液體發(fā)酵：去皮土豆600 g切成小塊，加入水3000 mL，煮沸30 min，利用兩層紗布過濾并取清液，加入60 g葡萄糖，定容至3000 mL。按照每瓶100 mL上述液體培養(yǎng)基分裝到250 mL三角瓶，在1.0 kPa壓力滅菌30 min，冷卻至室溫，在無菌操作環(huán)境下，接入靈芝原種，30℃下培養(yǎng)4 d，作為菌種。在以上100 mL培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，分別按照2‰、5‰、8‰添加中藥，以不添加中藥作為對照，于1.0 kPa壓力滅菌30 min，冷卻到室溫后，在無菌操作環(huán)境下，接入液體搖瓶菌種，30℃下培養(yǎng)7 d。用2層紗布過濾發(fā)酵液，取菌絲球于80℃烘箱中烘干至恒重。根據(jù)此處菌絲球生物量高低確定靈芝子實體栽培中添加中藥的比重。

靈芝栽培管理：麥草粉、麥麩和水按照4∶1∶10的比例混勻，分成9組，每組6瓶，分別添加2‰生姜、青蒿、黃連，5‰苦參、槐米花，8‰何首烏、葛根、山藥，以不添加中藥作為對照，按照每瓶105 g分裝到500 mL三角瓶，料面中央鉆1個直徑1 cm～2 cm的孔，孔深至瓶底，擦干靜瓶口，棉塞封口，用2層報紙包封瓶頭，1.0 kPa壓力滅菌1 h，冷卻至室溫。在無菌操作環(huán)境下，接入靈芝原種，然后在30℃下培養(yǎng)30 d。待菌絲長滿瓶，將三角瓶移入栽培室，直接放置于地面，控制空氣濕度在80%～90%。當(dāng)瓶內(nèi)靈芝子實體長至棉塞時，拔掉棉塞，讓子實體順利生長。整個生長階段控制光照強度為100 lx左右。當(dāng)子實體長至直徑5 cm～7 cm時采集子實體，并于80℃烘箱中烘干至恒重，備用。

1.3 子實體成分提取

將赤芝子實體6個重復(fù)樣分別用粉碎機粉碎，取1 g粉碎粉末加入10 mL無水乙醇，置于25 mL試管，用保鮮膜封口并于80℃水浴提取6 h，上清液經(jīng)無水乙醇稀釋5倍并在4℃冰柜中冷藏用于分析總黃酮、總靈芝三帖和總皂甙的含量；殘渣用10 mL水于80℃水浴提取6 h，取上清液，用于分析靈芝多糖的含量。

1.4 成分分析

1.4.1 多糖測定

采用苯酚硫酸法并作修改[14]。

1.4.2 黃酮測定

亞硝酸鈉－硝酸鋁法[15]。

1.4.3 三萜類測定

取1.3中無水乙醇上清液試樣1 mL，加入1 mL鹽酸密封于沸水浴水解6 h。采用王翔飛等描述的方法測定[16]。

1.4.4 皂甙測定

采用Pan Shu－yi描述的方法測定[17]，并加以修改。精密稱取上述人參皂甙標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL，分別置于試管中，各加無水乙醇至1 mL，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的香草醛冰乙酸溶液0.2 mL和0.8 mL高氯酸，于60℃水浴15 min，流動水冷卻，再加入3 mL冰乙酸，搖勻后置于室溫，在570 nm處測定吸光度值，并制作空白液作空白對照。以濃度－吸光度值做標(biāo)準(zhǔn)曲線。試樣測定方法取1 ml.3中無水乙醇上清稀釋液，依次加入上述試劑，并570 nm測定吸光度、計算含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 液體發(fā)酵生物量

靈芝液體發(fā)酵菌絲體生物量情況見表1。

表1 靈芝液體發(fā)酵菌絲體生物量

根據(jù)表1中菌絲球生物量，并且相互之間生物量差距不超過 0.2 g·100－1·mL－1， 以高劑量為依據(jù)確定幾種中藥的添加量，2‰干姜、青蒿、黃連，5‰苦參、槐米花，8‰何首烏、葛根、山藥。

2.2 成分分析

2.2.1 黃酮含量

許多文獻報道真菌在液體培養(yǎng)時具有富集轉(zhuǎn)化中藥的活性成分的功能，實驗首先考察了靈芝子實體是否具有這方面的功能。在選用的藥材中都含有黃酮，但是不同的中藥材黃酮的含量不同，而未見靈芝的子實體含有黃酮的報道，因此試驗首先以黃酮為指標(biāo)考察了靈芝子實體富集植物中的活性成分的能力，結(jié)果見圖1。

圖1 靈芝子實體中黃酮含量

圖1顯示添加中藥的靈芝子實體中都含有黃酮，而未添加中藥靈芝子實體 （對照）的未檢出黃酮，與對照相比，添加中藥后，靈芝子實體中黃酮含量顯著增加 （p＜0.05）。其中添加葛根、苦參和干姜培養(yǎng)的子實體中黃酮含量最高，同時添加其余幾種中藥的黃酮含量較低，說明靈芝具有富集植物中活性成分能力，盡管槐米花中黃酮含量比葛根、苦參和干姜高，但靈芝對槐米花中黃酮富集能力較差，說明靈芝對同一類成分不同組分富集能力不同。

2.2.2 多糖含量

多糖是靈芝的主要活性成分之一，大量文獻報道靈芝液體發(fā)酵菌絲體及子實體中含有豐富的多糖，并且在液體深層發(fā)酵菌絲中，添加適量一定種類的中藥對多糖的富集有一定促進作用，因此試驗考察了中藥對靈芝子實體多糖含量影響，結(jié)果見圖2。

圖2 靈芝子實體中多糖含量

圖2中除葛根在添加8‰的量下對固體栽培子實體中多糖含量沒有增強作用。其他7種中藥均顯著增加了靈芝子實體多糖的含量 （p<0.05），尤其以添加黃連和苦參，子實體多糖含量增加最為明顯。該結(jié)果說明不同的中藥對子實體多糖影響不同。

2.2.3 三萜含量

三萜類化合物是靈芝赤子實體中的另一類主要活性成分三萜類含量如圖3中所示。

圖3 靈芝子實體中三萜含量

從圖3中可以觀察到培養(yǎng)基中添加槐米花、苦參、黃連、山藥、干姜、葛根6種中藥有增加子實體中三萜含量，尤其以槐米花和苦參增加幅度較大。根據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析，與空白組作對比，只有苦參對子實體三萜含量具有顯著性影響 （p<0.05）。

2.2.4 皂甙含量

常見的有葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖及葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸等，常與皂甙元C3位的-OH連接成甙。皂甙可以分為三萜皂甙與甾體皂甙兩大類，發(fā)酵培養(yǎng)子實體皂甙含量如圖4所示。

圖4 靈芝子實體中皂甙的含量

由圖4可以看出，實驗中添加的8種中藥均對子實體皂甙成分的富集有促進作用，其中槐米花的促進作用最為明顯。同時添加中藥發(fā)酵子實體中皂甙含量依次為：槐米花＞山藥＞干姜＞苦參＞黃連＞葛根＞青蒿＞何首烏，并且差距非常明顯。根據(jù)統(tǒng)計分析，與對照組比較，表明槐米花、山藥、干姜、苦參4種中藥對靈芝字體皂甙含量的具有顯著的促進作用 （p<0.05）。

2.3 結(jié)論

靈芝子實體具有富集植物中活性成分的作用，同時植物中活性成分也有促進靈芝子實體中活性成分合成的作用，靈芝對不同的中藥以及同一類化合物不同的組分作用效果不同，同樣的不同中藥以及同一類中藥的不同的組分對靈芝子實體組分作用效果也不同。

添加中藥強化子實體有效成分的研究有待進一步深入研究。

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