張會芳，袁國楨，劉新民

(1.皖南醫(yī)學院 心理學教研室，安徽 蕪湖 241002;2.無錫市精神衛(wèi)生中心，江蘇 無錫 214151)

精神分裂癥是以思維、情感、行為之間不協(xié)調(diào)，精神活動和現(xiàn)實脫離為主要特征的一種常見精神病。精神分裂癥是一種全球性疾病，發(fā)病率高且難以治愈，帶給人們很大的經(jīng)濟負擔。盡管該病的病因尚未闡明，但多巴胺系統(tǒng)的異常調(diào)控在精神分裂癥的發(fā)病機制上一直處于主導地位［1］，因此與多巴胺生物合成、代謝或應答有關的基因就成為了該病的候選基因。本研究以DRD2和DAT為目的基因，探討外周血淋巴細胞DRD2和DAT的mRNA表達與精神分裂癥的關聯(lián)性。

1 對象與方法

1.1 研究對象 精神分裂癥組(以下稱患者組):共25例。入組標準:①符合美國精神障礙診斷與統(tǒng)計手冊第4版(DSM-Ⅳ)中精神分裂癥的診斷標準;②均為首發(fā)患者，既往未用過抗精神病藥物、抗抑郁劑及情感穩(wěn)定劑，且未做過電休克治療;③女性處于非妊娠、非哺乳期及非月經(jīng)期;④無重大軀體疾病、內(nèi)分泌疾病、自身免疫性疾病;⑤近3月內(nèi)未經(jīng)輸血治療;⑥無物質(zhì)依賴及濫用史;⑦自愿參加本研究，并由本人或法定監(jiān)護人簽署知情同意書。正常對照組28例。入組標準:①無精神疾病史、精神障礙家族史;②無重大軀體疾病、內(nèi)分泌疾病、自身免疫性疾病;③無物質(zhì)依賴及濫用史;④女性處于非妊娠、非哺乳期及非月經(jīng)期;⑤自愿參加本研究并簽署知情同意書;⑥與精神分裂癥患者同一地區(qū)的無血緣關系的群體。

1.2 試劑與儀器 ①SV Total RNA Isolation System試劑盒(Promega公司，美國);②SV RNA RED BLOOD CELL Lysis Solution(Promega公司，美國);③Reverse Transcription System試劑盒(Promega公司，美國);④ABI7500型PCR儀(ABI公司，美國)。

1.3 方法

1.3.1 標本采集 所有研究對象空腹抽取肘靜脈血1次2 ml，其中患者組采血須在治療前。全部血液標本采集后3 h內(nèi)進行總RNA的抽提。

1.3.2 陽性和陰性癥狀量表(PANSS)評定 在取血當天通過詢問病史、精神檢查，完成精神分裂癥患者的PANSS評定。

1.3.3 總 RNA抽提 總 RNA抽提采用 SV Total RNA Isolation System試劑盒(美國Promega公司)，紫外分光光度法測RNA的含量及純度，普通瓊脂糖凝膠電泳180 mV，35 min測其完整性。

1.3.4 逆轉(zhuǎn)錄反應 每樣本取400 ng的總RNA，利用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(美國Promega公司)進行逆轉(zhuǎn)錄反應，合成的cDNA第1鏈于－70℃保存。

1.3.5 引物序列 DRD2引物:上游引物為5'-ACTGGCGAGCAGACG GGAGGACCC-3'，下游引物為 5'-TGCGCGCGTGAGCTGCCGGTTCGG-3'。DAT引物:上游引物為5'-CAGCCTATGGAAGGGAGTAAA-3'，下游引物為 5'-CAGGAAAGTAGCCAGGACAAT-3'。GAPDH:上游引物為 5'-GAAGATGGTGATGGGATTT-3'，下游引物為5'-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-3'。所有引物序列運用引物設計軟件Primer Premier 5.00 設計，然后用 Oligo 6.69 軟件驗證，并在美國國立生物技術信息中心(NCBI)的基因庫中比對后得出可行性序列。所有引物序列均由上海生物工程公司合成。

1.3.6 聚合酶鏈反應(PCR) ①25 μL PCR反應體系。Mix:12.5 μl;模板:4 μl;上游引物(10 μmol/L):1.75 μl;下游引物(10 μmol/L):1.75 μl;水:加水定容至25 μl。上述反應體系配置好后，混勻離心，然后放置于ABI 7500 PCR儀中。②PCR循環(huán)步驟及條件，見表1。

1.4 數(shù)據(jù)處理 運用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件包對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理?；颊呓M和對照組間各指標進行成組t檢驗，檢驗前先進行方差齊性檢驗;檢測因素之間采用Spearman相關分析。所有檢驗均為雙側檢驗，數(shù)據(jù)均以±s表示，P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

表1 PCR擴增循環(huán)步驟及條件

2 結果

2.1 比較CT值法(△△CT) 選取RNA樣品模板進行100倍梯度稀釋，DRD2、DAT與GAPDH分別進行RT-PCR反應，得出熒光曲線，通過RNA濃度梯度的log值對目的基因與內(nèi)參基因的比較值(△CT)作圖比較兩基因擴增效率。RNA樣品稀釋100倍，對于每一個稀釋樣本，都用DRD2、DAT和GAPDH特異引物進行擴增。計算出DRD2、DAT和GAPDH的平均閾值(CT值)及△CT值，通過RNA濃度梯度的log值對△CT值作圖，所得直線斜率分別為 0.0287、0.0312，絕對值均接近于 0，說明目標基因DRD2、DAT和內(nèi)標基因的擴增效率相同，可以通過△△CT方法進行相對定量。

2.2 患者組與對照組DRD2與DAT基因表達水平的比較 本研究結果顯示，患者組與對照組間DRD2基因表達水平有顯著差異(P＜0.05)，而兩組間DAT基因表達水平差異沒有顯著性(P＜0.05)，見表2。

表2 兩組樣本DRD2與DAT基因表達水平比較

2.3 患者組 DRD2、DAT基因表達水平與 PANSS量表評分的相關分析 本研究發(fā)現(xiàn)患者組DRD2與PANSS量表陽性癥狀分間存在正相關(P＜0.05)，其他指標之間未發(fā)現(xiàn)有相關性存在，見表3。

表3 患者組DRD2、DAT基因表達水平與PANSS量表評分的相關分析

3 討論

在中樞組織中，多巴胺受體多集中在特定區(qū)域，局部密度高，而外周組織中的多巴胺受體則多分布彌散，局部數(shù)量遠低于中樞，故用放射配體結合實驗研究外周組織中多巴胺受體亞型定量是比較困難的。對于精神分裂癥的外周組織的研究，以往的實驗多采用ELISA、放免法(RLA)或生物測定法等對精神分裂癥的生化指標進行檢測。相同類型的實驗結果多不一致，使得此類研究一直難有定論［2］。隨著分子生物學技術的發(fā)展，國內(nèi)外逐漸開始采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)技術從轉(zhuǎn)錄層面來研究相關基因的mRNA表達情況和精神分裂癥之間的關系。RT-PCR技術具有很高的靈敏性，通過使用特異性引物可獲得較高的特異性。因此，本實驗應用RT-PCR技術來分析精神分裂癥患者與健康對照組外周血淋巴細胞DRD2及DAT的mRNA表達情況，測定外周組織DRD2、DAT表達和精神分裂癥的關系。

3.1 DRD2基因表達與精神分裂癥 本研究用定量RT-PCR研究發(fā)現(xiàn):和健康人相比，精神分裂癥患者外周血淋巴細胞DRD2表達增強。本研究血樣是從首次發(fā)作的患者抽取的，這排除了藥物對基因表達水平的影響。這一研究結果與Zvara等研究結果一致［3］，該研究用RT-PCR和微陣列技術研究發(fā)現(xiàn)外周血淋巴細胞DRD2基因表達增強。

精神分裂癥的主要假說是多巴胺系統(tǒng)功能紊亂，特別是多巴胺D2族受體占據(jù)增加［4］，Roberts等用RT-PCR技術研究發(fā)現(xiàn)，精神分裂癥患者DRD2基因的兩種亞型在一些腦區(qū)域表達增強［5］，Tallerico等用競爭性定量RT-PCR技術發(fā)現(xiàn)，服藥或近期未服藥的精神分裂癥患者，死后前額皮層區(qū)域長型DRD2 mRNA表達水平增強［6］。精神分裂癥患者尸檢結果發(fā)現(xiàn)紋狀體DRD2密度增高［7］。這說明外周血DRD2基因表達水平增強與腦部相應區(qū)域DRD2 mRNA表達結果一致，外周DRD2基因mRNA的表達情況可在某種程度上反映腦部DRD2 mRNA的表達情況，可作為精神分裂癥的診斷和療效評價的一個外周標記。

3.2 DAT基因表達與精神分裂癥 有關多巴胺轉(zhuǎn)運體的研究結果不一，中樞DAT研究顯示精神分裂癥多巴胺能系統(tǒng)功能改變不影響多巴胺轉(zhuǎn)運體密度的變化［8］，Laruelle等用SPECT研究發(fā)現(xiàn)精神分裂癥紋狀體轉(zhuǎn)運體密度沒有變化［9］。尸檢研究也沒發(fā)現(xiàn)精神分裂癥紋狀體轉(zhuǎn)運體密度有變化。但Tatsch等用SPECT研究顯示精神分裂癥紋狀體轉(zhuǎn)運體密度比對照組低［10］。Laakso A等報道慢性精神分裂癥患者的DAT表達減少［11，12］，有研究報道初發(fā)精神分裂癥患者多巴胺轉(zhuǎn)運蛋白沒有變化［13］。Hirai等報道尸體解剖發(fā)現(xiàn)精神分裂癥患者的多巴胺轉(zhuǎn)運蛋白密度沒有變化［14］。有關外周血淋巴細胞中多巴胺轉(zhuǎn)運體的研究不多，本研究發(fā)現(xiàn)精神分裂癥患者外周血淋巴細胞DAT mRNA表達較正常對照組增強。

3.3 DRD2、DAT基因表達與臨床癥狀的關系 本研究發(fā)現(xiàn)，精神分裂癥患者DRD2 mRNA表達與PANSS量表陽性癥狀分呈正相關，與總分、陰性癥狀、精神病理學癥狀分無相關性存在。這說明DRD2 mRNA表達越強，精神分裂癥患者癥狀越嚴重，陽性癥狀，包括幻覺、思維散漫、猜疑和妄想越嚴重，而對陰性癥狀和精神病理學癥狀無影響。有研究發(fā)現(xiàn)中樞DRD2增強與陽性癥狀關系密切［15］，因此本結果與其研究結果一致。由于經(jīng)典藥物的療效主要是通過DRD2介導，因此有學者認為陽性癥狀與DRD2的功能異常有關［15］。但沒有發(fā)現(xiàn) DAT mRNA表達與PANSS量表陽性癥狀、陰性癥狀、精神病理學癥狀及PANSS總分有相關性。

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