熊延靖，董 群

(皖南醫(yī)學院 微生物學與免疫學教研室，安徽 蕪湖 241002)

白色念珠菌(Candida.albicans，C.albicans)是寄居在正常人體消化道、呼吸道和女性生殖道黏膜上的正常菌群，也是念珠菌屬中最常見的一種條件致病菌。近年來，由于免疫抑制劑的大量應用，腫瘤放療、化療，侵入性治療，器官移植的開展，以及大量廣譜抗生素的廣泛應用導致正常菌群失調，白色念珠菌的感染率和發(fā)病率較以往有明顯的增加［1，2］。1995～2002年美國49所醫(yī)院連續(xù)7年的監(jiān)測資料表明，念珠菌敗血癥在醫(yī)院感染敗血癥中居第4位，病死率則居首位［3］。目前臨床對該病的診斷主要依靠血培養(yǎng)和組織病理檢查，但陽性率低且耗時長，致使不少患者因病情延誤導致治療失敗，甚至喪失生命。因此，快速、準確地從臨床標本中直接檢出白色念珠菌對于疾病的早期診斷和治療具有十分重要的意義。隨著分子生物學的發(fā)展，包括PCR法在內的多種分子生物學技術開始應用于真菌病的診斷和研究，其敏感性高、特異性強、重復性好、快捷方便等優(yōu)點引起了廣大學者的高度關注。本研究旨在通過建立白色念珠菌DNA提取法和了解PCR檢測的靈敏度，為進一步探索PCR技術在臨床白色念珠菌的鑒定和白色念珠菌病的早期診斷中的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株 白色念珠菌(Candida.albicans，C.albicans)標準菌株:AX2-2086，購自廣州市微生物研究所。臨床分離念珠菌兩株，經科馬嘉培養(yǎng)基及API 20C AUX酵母菌鑒定系統(tǒng)鑒定，為白色念珠菌。

1.2 主要試劑與儀器 改良沙氏(Sabourand)固體培養(yǎng)基，ACD抗凝劑，紅細胞裂解液，白細胞裂解液，瓊脂糖，10×TAE緩沖液，1%瓊脂糖凝膠，Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒;引物1，2:根據真菌內轉錄間隔區(qū)(ITS)設計通用引物一對，由上海生工生物技術有限責任公司合成。ITS1:5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3'，ITS4:5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3';ESCO CLASSⅡBSC生物安全柜，MC012532型PCR熱循環(huán)分析儀，BIO-RAD凝膠成像分析系統(tǒng)，ZF型紫外分析儀。

1.3 方法

1.3.1 白色念珠菌培養(yǎng)及菌液制備 將白色念珠菌標準菌株及兩株臨床分離菌株分別接種于改良沙氏固體培養(yǎng)基上，37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，經無菌生理鹽水洗下制成菌懸液，血球計數(shù)板調至濃度為2×107/ml，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 白色念珠菌DNA的提取 用無菌生理鹽水分別洗下培養(yǎng)48 h的白色念珠菌苔(標準菌株及臨床分離菌株)，9 000 rpm離心1 min，棄去上清，收集菌體。按Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取上述菌株DNA。

1.3.3 PCR特異性擴增 PCR反應成分(終濃度):1 × PCR Buffer液，1.5 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L dNTP，0.2 μmol/L 上、下游引物，DNA 模板，2.5U Taq DNA聚合酶，滅菌去離子水混至50 μl。擴增程序為:94℃預變性5 min、94℃變性30 s、58 ℃退火 60 s、72 ℃ 延伸 60 s，35 個循環(huán)、72 ℃延伸7 min。擴增完畢后，產物于4℃保存，等待電泳。

1.3.4 PCR擴增產物檢測 取擴增產物依次點樣于1% 瓊脂糖凝膠(含 EB 0.5 μg/ml)，于1×TAE電泳緩沖液中電泳，在紫外分析儀和BIO-RAD凝膠成像分析系統(tǒng)上進行分析、照相。

1.3.5 PCR敏感度測定 抽取健康人血液經ACD抗凝劑抗凝后，加入白色念珠菌標準菌株菌液，使其濃度依次為:1×106個/ml、1×105個/ml、1×104個/ml、1 ×103個/ml、1 ×102個/ml、1 ×101個/ml、1×100個/ml，制備成血液白色念珠菌感染模擬標本。取各濃度白色念珠菌感染模擬標本1 ml移入滅菌的Ep管中，加入0.8 ml紅細胞裂解液，充分混勻后置37°C水浴箱中孵育10 min后取出，5 000 rpm離心10 min。重復此步驟一次。然后棄去上清，在沉淀中加入白細胞裂解液1 ml，充分振蕩混勻后置65°C水浴箱中孵育1 h，取出，5 000 rpm 離心10 min，棄去上清，收集沉淀。按Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取DNA，PCR擴增，并設立陽性對照和陰性對照。

2 結果

2.1 白色念珠菌DNA的提取及PCR擴增結果見圖1。

白色念珠菌標準菌株及臨床分離菌株經DNA提取和PCR擴增后，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果顯示，除陰性對照未見條帶外，其余各樣本均可擴增出約為500 bp的特異性條帶。

圖1 PCR產物電泳圖譜Fig 1 Electrophoregram of PCR products

2.2 PCR敏感度測定結果 見圖2。

從白色念珠菌標準菌株濃度分別為1×106個/ml、1 ×105個/ml、1 ×104個/ml、1 ×103個/ml、1 ×102個/ml、1 ×101個/ml、1 ×100個/ml的血液感染模擬標本中提取DNA并經PCR擴增后，于1% 瓊脂糖電泳檢測。結果顯示，除陰性對照未見條帶外，其余各樣本均可擴增出約為500 bp的特異性條帶。

圖2 不同濃度白色念珠菌PCR產物電泳圖譜Fig 2 Electrophoregram of PCR products from different concentration of Candida albicans

3 討論

系統(tǒng)性白色念珠菌病由于臨床癥狀不典型，患者的臨床表現(xiàn)亦無特異性，極易與細菌感染相混淆，故早期臨床診斷比較困難。目前對該病的診斷主要依靠血培養(yǎng)和組織病理檢查，但由于念珠菌病菌血癥持續(xù)時間短且活菌數(shù)少［4］，而組織穿刺往往不易被病人接受，且穿刺部位及所取組織量也會影響診斷結果。導致檢測結果陽性率低且耗時長(通常需5～7 d)，致使不少患者因延誤治療而病情加重甚至死亡。

近年來，隨著分子生物學技術的發(fā)展，分子手段開始廣泛地應用到臨床疾病的診斷中。真菌DNA的提取方法有很多種，如氯化芐法［5］、蝸牛酶破壁法［6］、液氮研磨法［7］等。在本實驗中，我們采用Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒提取白色念珠菌標準菌株及兩株臨床分離菌株的DNA，并進行PCR擴增。所采用的引物為內轉錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer region，ITS)通用引物 ITS1和ITS4。ITS1與18S rDNA的一段序列互補，具有一定的種間特異性和種內保守性。該對引物擴增片段包括ITSⅠ區(qū)、ITSⅡ區(qū)和5.8S rDNA。通過與標準分子量(2 000 ku)比較，該引物能將白色念珠菌DNA擴增出500 bp左右的特異性條帶，與文獻報道一致［8］。

在血液白色念珠菌感染模擬標本中，我們采用紅、白細胞裂解液處理全血標本后，按照Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取DNA并進行PCR擴增，同樣擴增出500 bp左右的特異性條帶，并且能檢測出1×100個/ml的白色念珠菌。說明此種方法在檢測血液樣本中白色念珠菌的敏感度高，可行性好，結果穩(wěn)定。

全血白色念珠菌從DNA提取到PCR擴增的全部過程只需6 h，遠遠低于血培養(yǎng)和組織病理檢查的時間，大大縮短了臨床診斷時間，為疾病的治療爭取時間。說明PCR法不僅靈敏度高、特異性強，而且具有快速、方便、重復性好的優(yōu)點，可以為白色念珠菌感染的早期診斷提供實驗依據。

［1］廖萬清，吳紹熙.病原真菌生物學研究與應用［M］.第1版.北京:化學工業(yè)出版社，2006:106-107.

［2］廖萬清，顧菊林.深部真菌感染治療的現(xiàn)狀與對策［J］.中國感染與化療雜志，2007，7(2):101-103.

［3］WISPLINGHOFF H，SEIFERT H，TALLENT SM，et al.Nosocomial bloodstream infections in pediatric patients in United States hospitals:epidemiology，clinical features and susceptibilities［J］.Pediatr Infect Dis J，2003，22(8):686-691.

［4］GAVIRIA JM，VAN BURIK JA，DALE DC，et al.Comparison of interferon-gamma，granulocyte colony-stimulating factor，and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor for priming leukocytemediated hyphal damage of oppeotunisticfungal pathogens［J］.J Infect Dis，1999，179(4):1038-1041.

［5］朱衡，瞿峰.利用氯化芐提取適于分子生物學分析的真菌DNA［J］.真菌學報，1994，13(1):34-40.

［6］王萍，董群，厲榮玉.白假絲酵母菌分離和鑒定方法的探討［J］.皖南醫(yī)學院學報，2007，26(2):91-93.

［7］張明，趙呈裕.絲狀真菌高分子量DNA的提取研究［J］.廣西醫(yī)科大學學報，1998，15(2):41-43.

［8］SCHALLER M，BOELD U，OBERBAUER S，et al.Polymorphonuclear leukocytes(PMNs)induce protective Th1-type cytokine epithelial responses in an in vitro model of oralcandidosis［J］.Microbiology，2004，150(9):2807-2813.