吳問亮，徐善水

(皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院 神經(jīng)外科，安徽 蕪湖 241001)

蛛網(wǎng)膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage，SAH)后腦血管痙攣(Cerebral Vasospasm，CVS)最早由Ecker和Riemenschneider在1951年提出，并經(jīng)腦血管造影證實。近半個世紀(jì)以來，關(guān)于SAH后CVS產(chǎn)生的原因有大量的研究，一般認(rèn)為SAH后CVS的發(fā)生是多因素、多環(huán)節(jié)的。最近的研究表明，SAH后血管內(nèi)皮細(xì)胞存在凋亡，且血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡在CVS形成機制中具有重要作用［1］。

NF-kB(核轉(zhuǎn)錄因子-kB)是 1986 年由 Sen 和Bltimore［2］在成熟的B淋巴細(xì)胞發(fā)現(xiàn)的一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，因其能夠與B細(xì)胞免疫球蛋白的K親鏈基因的增強子kB序列(5'GGGACTTTCC3')特異結(jié)合而得名。研究表明，活化的NF-kB在細(xì)胞凋亡中具有抗凋亡和促凋亡雙重作用。一些實驗研究觀察到在不同類型的細(xì)胞培養(yǎng)和體內(nèi)模型中，NF-kB的活化可阻止細(xì)胞凋亡，抑制NF-kB活性可加重組織的損傷。Hill等［3］在大鼠的大腦中動脈缺血再灌注模型中，用NF-kB抑制劑PDTC(吡咯烷二硫代甲酸氨鹽)抑制NF-kB的活化后發(fā)現(xiàn)腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡和腦組織的梗死體積較對照組明顯增加。但關(guān)于NF-kB的活化對細(xì)胞凋亡的作用，也有學(xué)者得出相反的結(jié)果。肖國民等［4］使用β-七葉皂甙治療創(chuàng)傷性腦水腫發(fā)現(xiàn)β-七葉皂甙可以抑制NF-kB的活性，進而達到減輕腦水腫的作用。

以上研究均表明，腦部在受到各種刺激后，NF-kB在中樞神經(jīng)系統(tǒng)各部位均有表達，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)DCVS的這種凋亡現(xiàn)象既包括了海馬、皮層等對缺血缺氧敏感的部位，也包括了基底節(jié)、皮質(zhì)下等對缺血缺氧相對耐受的部位。然而，SAH后CVS所致的腦損害過程中，NF-kB與痙攣血管壁內(nèi)皮細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞之間的關(guān)系如何，是促進內(nèi)皮細(xì)胞凋亡還是抑制凋亡?需要做進一步的研究。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 成年新西蘭白兔40只，雌雄不分，兔齡4～6個月［南京青龍山動物實驗中心提供，許可證號:scxk(蘇)(2007-0008)，體重2.0 ～2.5 kg］。

1.2 試劑 即用型SABC免疫組化染色試劑盒(5%BSA封閉液，二抗:山羊抗兔IgG，SABC:鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物)，細(xì)胞凋亡試劑盒(標(biāo)記緩沖液，末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶TDT，DIG-dUTP，封閉液，生物素化抗地高辛抗體，SABC，ProteinaseK，抗體稀釋液)，PDTC，以上材料均由武漢博士德公司提供。

1.3 動物分組 新西蘭純種大白兔40只，雌雄不限，月齡4 ～6 個月，平均體重(2.1 ±0.4)kg。按照完全隨機的原則分三組:對照組、SAH組和干預(yù)組。其中空白對照組8只，SAH組根據(jù)不同時間點分為SAH 3 d組、SAH 7 d組、SAH 14 d組、每組8只，干預(yù)組8只為在7 d時間點注血后加入NF-kB的抑制劑PDTC(吡咯烷二硫代甲酸氨鹽)SAH+PDTC。

1.4 SAH模型的制作 采用3%戊巴比妥(30 mg/kg)，外緣耳靜脈麻醉，用22G雙腔套管針與軀體成角約30°穿刺枕大池，方向指向右眼外眥，當(dāng)穿破環(huán)枕筋膜時有突破感，停止進針，退出針芯。按照0.8 ml/kg的劑量緩慢抽取腦脊液，自耳中央動脈快速抽取自體動脈血0.8 ml/kg緩慢注入枕大池，歷時30 s。48 h后重復(fù)上述過程。

1.5 標(biāo)本及病理切片的制備 實驗兔分別在各時間點處死，將顱頂枕骨及上段頸椎棘突和雙側(cè)椎板咬除，取出腦組織及附有基底動脈全長的腦干部分。用于形態(tài)學(xué)觀察的標(biāo)本直接投入10%的福爾馬林中，脫水后石蠟包埋，在切片機上切成5 μm的切片。HE染色，免疫組化染色方法(SABC法)，TUNEL法檢測基底動脈細(xì)胞凋亡均根據(jù)試劑盒要求操作。

2 結(jié)果

2.1 基底動脈管徑和厚度測量 對照組基底動脈內(nèi)徑及管壁厚度基本正常。SAH組3 d、7 d、14 d與對照組相比管徑明顯變狹窄、管壁明顯增厚，有顯著差異，均產(chǎn)生腦血管痙攣，以7 d最為顯著。在7 d時間點，與SAH組動脈內(nèi)徑比較，SAH+PDTC組痙攣血管明顯緩解(見表1，圖1、2)

表1 對照組與SAH各組不同時間點兔基底動脈直徑變化(102μm，±s)Tab1 Changes in rabbits of the basilar artery diameter at different time points between control group and SAH group(102μm，±s)

表1 對照組與SAH各組不同時間點兔基底動脈直徑變化(102μm，±s)Tab1 Changes in rabbits of the basilar artery diameter at different time points between control group and SAH group(102μm，±s)

SAH組與對照組比較，▲P＜0.05(SNK-q檢驗);干預(yù)組與SAH 7 d比較，★P ＜0.05(SNK-q檢驗)

組別 n 直徑 F值 P值23.99 ±2.00 SAH 3 d 組 8 15.80 ±2.40▲SAH 7 d 組 8 11.09 ±1.54▲ 59.233 ＜0.01 SAH 14 d 組 8 17.46 ±0.98▲干預(yù)組 8 19.60 ±1.47對照組8★

2.2 基底動脈壁NF-kB的表達 光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn):NF-kB免疫組化染色后細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為NF-kB陽性表達細(xì)胞。每張切片隨機選取5個不重疊視野，采用病理圖文管理系統(tǒng)4.10(北航圖像中心)記錄陽性細(xì)胞百分比。

NF-kB免疫陽性反應(yīng)主要在基底血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞胞核內(nèi)表達，著色均勻，對照組僅有NF-kB少量表達。SAH組NF-kB表達明顯從胞漿移位于胞核。在注血后3 d，NF-kB的免疫陽性反應(yīng)在內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和邊緣部位可以觀察到，呈淺黃色;注血后7 d，NF-kB免疫陽性反應(yīng)可以在整個動脈壁內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞內(nèi)觀察到，著色均勻呈棕黃色且胞核染色增強;注血后14 d，NF-kB的免疫陽性反應(yīng)明顯減弱。SAH+PDTC組對NF-kB陽性細(xì)胞表達較SAH 7 d組明顯下降(P＜0.05)(見表 2，圖3、4)。

表2 對照組與SAH各組不同時間點兔基底動脈NF-kB陽性細(xì)胞百分比變化(%，±s)Tab 2 Percentage fluctuation of the positive cells of the NF-kB in basilar artery of rabbits at separate time points between control group and SAH group(%，±s)

表2 對照組與SAH各組不同時間點兔基底動脈NF-kB陽性細(xì)胞百分比變化(%，±s)Tab 2 Percentage fluctuation of the positive cells of the NF-kB in basilar artery of rabbits at separate time points between control group and SAH group(%，±s)

SAH組與對照組比較，▲P＜0.05(SNK-q檢驗);干預(yù)組與SAH 7 d比較，★P ＜0.05(SNK-q檢驗)

組別 n NF-kB陽性百分比變化 F值 P值6.54 ±0.48 SAH 3 d 組 8 34.07 ±1.61▲SAH 7 d 組 8 68.31 ±2.06▲ 1955.508 ＜0.01 SAH 14 d 組 8 39.35 ±1.18▲干預(yù)組 8 33.44 ±1.18正常對照組8★

2.3 凋亡細(xì)胞TUNEL檢測結(jié)果 結(jié)果判定:細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞，即凋亡的細(xì)胞。TUNEL反應(yīng)呈陽性的內(nèi)皮細(xì)胞定位在皺縮的內(nèi)彈力層表面，呈陽性反應(yīng)的平滑肌細(xì)胞定位在血管中膜。在SAH組各時間點，細(xì)胞凋亡指數(shù)隨時間呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。SAH 7 d組基底動脈內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞核呈顯著的TUNEL陽性反應(yīng)。在SAH+PDTC組，有少量呈陽性表達的內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，細(xì)胞凋亡指數(shù)較SAH 7 d組顯著下降(P＜0.05)。對照組的標(biāo)本中幾乎沒有TUNEL反應(yīng)陽性細(xì)胞(見表3，圖5、6)。

表3 對照組與SAH組不同時間點兔基底動脈細(xì)胞凋亡指數(shù)變化(%，±s)Tab3 Change of the apoptosis index for basilar artery of rabbits at different time points between control group and SAH group(%，±s)

表3 對照組與SAH組不同時間點兔基底動脈細(xì)胞凋亡指數(shù)變化(%，±s)Tab3 Change of the apoptosis index for basilar artery of rabbits at different time points between control group and SAH group(%，±s)

SAH組與對照組比較，▲P＜0.05(SNK-q檢驗);干預(yù)組與SAH 7 d比較，★P ＜0.05(SNK-q檢驗)

組別 n 凋亡指數(shù) F值 P值2.33 ±0.15 SAH 3 d 組 8 10.49 ±1.00▲SAH 7 d 組 8 16.49 ±1.16▲ 267.143 ＜0.01 SAH 14 d 組 8 10.38 ±0.74▲干預(yù)組 8 9.70 ±0.93對照組8★

3 討論

3.1 內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和腦血管痙攣 細(xì)胞凋亡又稱程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death，PCD)，是指細(xì)胞在一定的生理或病理條件下，通過啟動其自身內(nèi)部機制而發(fā)生的細(xì)胞自殺性死亡過程。細(xì)胞凋亡形態(tài)上表現(xiàn)為胞核致密深染、胞體變小。本實驗發(fā)現(xiàn)，對照組實驗兔基底動脈TUNEL染色僅見微量凋亡內(nèi)皮細(xì)胞表達;在SAH組3 d、7 d、14 d各時間點兔基底動脈形態(tài)學(xué)顯示的血管痙攣改變(包括血管直徑變狹窄和血管厚度增加)先加重后緩解，與之對應(yīng)SAH組各時間點兔基底動脈TUNEL染色呈陽性反應(yīng)的內(nèi)皮細(xì)胞先增加后減少，細(xì)胞凋亡指數(shù)先上升后減少，說明SAH后CVS的出現(xiàn)是與內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的發(fā)生相伴隨的。而國內(nèi)外一些學(xué)者［5］認(rèn)為凋亡在7 d以前表達最為明顯，而血管痙攣發(fā)生在凋亡之后。分析其不同原因可能在于:①實驗選取的動物不同。在本次實驗中，我們選用兔制作SAH后CVS模型是因為兔腦內(nèi)外循環(huán)之間沒有豐富的血管網(wǎng)溝通，其血管類型比貓狗更接近于人，枕大池注血方法相對簡單且血管痙攣效果滿意。在SAH后CVS的發(fā)展時序中，兔已被證明表現(xiàn)為雙時相，即早期CVS和遲發(fā)性CVS，此過程與人類CVS的發(fā)展時序相似。②注血方法的不同。本實驗采用二次注血法優(yōu)點在于操作簡單，而且可以很好地控制出血速度和出血量。注血法是由于腦池內(nèi)血塊分解出代謝產(chǎn)物氧合血紅蛋白，而氧合血紅蛋白被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的主要誘因，其再作用于血管內(nèi)皮需要一段時間，因而可能表現(xiàn)為凋亡時間延遲。注血法不足之處在于反復(fù)穿刺可加重癥狀，本實驗中時間窗過小也可能是導(dǎo)致結(jié)果不同的一個原因。③此外，注血量的不同也可能導(dǎo)致痙攣出現(xiàn)的時間不一樣。2002年，Zubkov等［6］用電鏡和腦血管造影觀察犬SAH模型后3 d、5 d和7 d內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)改變與CVS的關(guān)系，結(jié)果顯示注血后第3天內(nèi)皮細(xì)胞開始出現(xiàn)核染色體邊集濃縮、胞膜芽生出泡和胞漿濃縮等凋亡樣改變。并且上述病理改變的程度和范圍與基底動脈痙攣程度和時程相一致，于基底動脈痙攣程度最嚴(yán)重的第7天達高峰。與本實驗研究結(jié)果一致。正常情況下，內(nèi)皮細(xì)胞襯貼在血管內(nèi)壁，通過細(xì)胞間緊密連接形成單層連續(xù)的腔面，是物質(zhì)轉(zhuǎn)運的屏障。研究表明，SAH后CVS血管壁存在細(xì)胞凋亡，而且細(xì)胞凋亡在CVS形成過程中起著重要作用。其可能機制是，凋亡導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能發(fā)生變化，造成縮血管和擴血管物質(zhì)分泌失衡，NO和前列環(huán)素等擴血管物質(zhì)顯著減少，引起血管收縮;另一方面，內(nèi)皮細(xì)胞凋亡導(dǎo)致血管完整性破壞，從而將血管平滑肌暴露于縮血管物質(zhì)，加劇了CVS。此外，受損的內(nèi)皮細(xì)胞還可引發(fā)血栓形成，造成血管狹窄，加重CVS后缺血性腦損傷［7］。

3.2 NF-kB與細(xì)胞凋亡 本次實驗中應(yīng)用免疫組化實驗檢測NF-kB蛋白的表達，NF-kB陽性細(xì)胞表現(xiàn)為胞核黃染。我們發(fā)現(xiàn)在注血后3 d，NF-kB的免疫陽性反應(yīng)在內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和邊緣部位可以觀察到，呈淺黃色;注血后7 d，NF-kB免疫陽性反應(yīng)可以在整個動脈壁內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞內(nèi)觀察到，著色均勻呈棕黃色且胞核染色增強;注血后14 d，NF-kB的免疫陽性反應(yīng)明顯減弱。應(yīng)用 PDTC(NF-kB特異性抑制劑)對兔二次枕大池注血后CVS的干預(yù)發(fā)現(xiàn)，在緩解基底動脈形態(tài)學(xué)改變的同時可以減輕基底動脈細(xì)胞凋亡指數(shù)及NF-kB表達;用TUNEL測定凋亡的細(xì)胞發(fā)現(xiàn)與NF-kB表達的時間一致。國內(nèi)周政等［8］用兔二次枕大池注血發(fā)現(xiàn)NF-kB蛋白在出血后7 d達高峰，隨后逐漸回落。與本實驗研究結(jié)果一致。Hickenbottom等［9］用二次注血法誘導(dǎo)犬腦出血模型，發(fā)現(xiàn)在出血后4 d NF-kB水平升高1.8～2.5倍，分析其不同結(jié)果原因可能在于實驗動物的不同和注血量的差異所造成。以上結(jié)果均表明NF-kB可以促進細(xì)胞凋亡，且與凋亡程度一致。關(guān)于NF-kB對內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用機制，我們可以從以下幾個方面來探討。

3.2.1 NF-kB與促凋亡基因 近年，對腦血管病研究的重要進展就是腦缺血誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程中，凋亡相關(guān)基因的表達及作用。研究證實，SAH后，可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生促凋亡因子如P53、C-myc、Bax等，經(jīng)過級聯(lián)反應(yīng)，最后激活蛋白酶Caspase導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。半胱天冬酶(caspase)是一類半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase或Casp)家族的簡稱，是一切凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的共同通路。Bcl-2(B淋巴細(xì)胞瘤基因)家族是與細(xì)胞凋亡相關(guān)中最受關(guān)注的基因之一。Bax與Bcl-2的相對比值在決定細(xì)胞生存或死亡中可能起關(guān)鍵作用。正常情況下Bcl-2/Bax比例保持著動態(tài)平衡，當(dāng)在病理情況下，比值下降時，細(xì)胞就開始凋亡［10］，報道低氧可誘導(dǎo) NF-kB 活化，從而降低凋亡抑制因子 bcl-2蛋白的表達，使促凋亡因子caspase-3活性增加，引起細(xì)胞凋亡。Zhou等［11］在犬二次注血致CVS的模型中發(fā)現(xiàn)基底動脈Bax表達明顯升高，而Bcl-2明顯降低，同時也發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞凋亡。這也表明Bcl-2家族在SAH后CVS的血管壁細(xì)胞的凋亡中扮演重要角色。p53是最常見的促凋亡基因，具有降低bcl-2、升高bax蛋白的作用。另有利用轉(zhuǎn)基因小鼠證明，缺失p53對腦缺血有保護作用，降低p53表達可以緩解SAH后血管痙攣［12］，NF-kB 激活后，也可以上調(diào) C-myc基因的表達，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

3.2.2 NF-kB 與 NO、NOS NO(nitric oxide，一氧化氮)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種可逆信使及氣體性神經(jīng)遞質(zhì)，對維持血管舒張，血流量及血壓調(diào)節(jié)起重要作用。NOS(nitric oxide synthase，一氧化氮合成酶)是NO生物合成調(diào)節(jié)最關(guān)鍵的因素，是合成NO的關(guān)鍵酶，其亞型可分為誘導(dǎo)型NOS(induced NOS，iNOS)，內(nèi)皮型 NOS(endothelial NOS，eNOS)和神經(jīng)元型NOS(neurons NOS，nNOS)。iNOS在通常狀況下不表達，在某些病理條件下如高血壓，蛛網(wǎng)膜下腔出血等條件下可誘導(dǎo)表達。由iNOS誘導(dǎo)生成的NO在氧化應(yīng)激中生成的某些過氧化亞硝酸鹽陰離子可損傷腦血管并可使血管壁發(fā)生重構(gòu)而狹窄。我國臺灣學(xué)者Chih-Lung Lin等［13］報道雌二醇能夠抑制NF-kB的表達來降低iNOS的生成，并通過降低內(nèi)皮素的合成來起到腦保護的作用。其機制在于:iNOS在5區(qū)存在NF-kB的目的基因，NF-kB被激活后能引起iNOS表達的增加，而雌激素可競爭性P65受體來影響NF-kB的生成，從而進一步來抑制iNOS的合成。NO一方面通過產(chǎn)生高反應(yīng)性自由基、脂質(zhì)過氧化、抑制線粒體酶、干擾基因轉(zhuǎn)錄以及參與炎癥反應(yīng)等作用導(dǎo)致細(xì)胞損傷，另一方面又有阻止細(xì)胞色素C的釋放、抑制cGMP2依賴的凋亡、降低半胱天冬氨酸酶活性等細(xì)胞保護機制，故NO生成增多在CVS中的作用尚需進一步明確。

3.2.3 NF-kB與TRAF家族 腫瘤壞死因子受體偶聯(lián)因子(Tumor necrotic factor receptor associated factor，TRAF)家族是一種重要的接頭分子，目前發(fā)現(xiàn)的人類TRAF分子中以TRAF-2研究較為廣泛。TRAF-2分子在NF-kB激活的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中扮演重要的角色。通過激活NF-kB誘導(dǎo)激酶(NF-kB inducing kinase，NIK)，由 NIK 活化 NF-kB 和 I-kB 的復(fù)合物，引起I-kB降解，釋放有活性的NF-kB，通過激活凋亡執(zhí)行蛋白 Caspase，從而誘發(fā)細(xì)胞凋亡。Zhou等［11］報道了NF-kB在SAH后CVS中的變化，最終發(fā)現(xiàn)SAH組的NF-kBDNA結(jié)合活性的基因表達量均顯著增加，而給予NF-kB抑制劑組中，其含量均顯著降低。

由于NF-kB是一種轉(zhuǎn)錄因子，其生物學(xué)作用就缺血再灌注損傷方面而言，涉及到炎癥、自由基、凋亡等諸多病理過程，簡單地去界定其一方面的作用，是目前各研究產(chǎn)生不同甚至相反結(jié)果的一個重要原因。NF-kB活化的調(diào)控是一個非常精細(xì)的過程，除受細(xì)胞因素的影響外，還與機體的內(nèi)環(huán)境有關(guān)。何時誘導(dǎo)NF-kB活化?以及活化的持續(xù)時間及強度如何控制?由于NF-kB所涉及的調(diào)控機制眾多，所以關(guān)于其在SAH后在引起遲發(fā)性血管壁病理變化的機制還需進一步研究，而且這些方面的研究可能為臨床藥物的開發(fā)及SAH后CVS的治療開辟新的道路。

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