張 玲，桂淑玉，左 莉，何 葦，周 青，汪 淵

(1.皖南醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002;2.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，安徽 合肥 230022;3.安徽醫(yī)科大學(xué) 分子生物學(xué)實驗室，安徽 合肥 230022)

肺癌居全球癌癥病死率之首，目前化學(xué)藥物應(yīng)用在其治療過程中仍起到重要作用。N-(4-羥基苯基)維生素甲酰胺(4-HPR)是反式維甲酸(ATRA)的衍生物之一，它將ATRA羧基端以一個酰胺基所連接的4-羥苯基取代，是一種活性很高的凋亡誘導(dǎo)因子［1］。本研究觀察了4-HPR對人肺腺癌細(xì)胞株A549體外生長抑制作用和誘導(dǎo)凋亡情況，并對其機制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 試劑 ATRA和4-HPR購于Sigma公司，用二甲基亞砜(DMSO)溶解各配制成10 mmol/L的儲備液，-20℃避光保存，使用前用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋到所需濃度。細(xì)胞凋亡-Hoechst染色試劑盒購于Beyotime公司。

1.2 實驗分組、細(xì)胞培養(yǎng)和倒置顯微鏡觀察 實驗分6個組，即細(xì)胞對照組、溶劑對照組(1‰的DMSO)、1 μmol/L ATRA 組、5 μmol/L ATRA 組、1 μmol/L 4-HPR 組、5 μmol/L 4-HPR 組。將肺腺癌細(xì)胞A549培養(yǎng)于含10%小牛血清(購于杭州四季青生物公司)的DMEM(GIBICO公司)培養(yǎng)基中，置37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞呈對數(shù)期生長時加藥處理，3 d后倒置顯微鏡下觀察6個處理組細(xì)胞生長情況及形態(tài)變化，并拍照記錄。肺腺癌細(xì)胞株購于ATCC，由安徽醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)實驗室保存。

1.3 Hoechst 33258凋亡染色 取普通潔凈無菌處理蓋玻片置于24孔板內(nèi)，按4×104/孔種入細(xì)胞，次日更換培養(yǎng)基，按1.2中實驗分組培養(yǎng)，每組4個實驗復(fù)孔。待細(xì)胞長至約50%～60%時進(jìn)行染色。吸盡培養(yǎng)液，固定20 min;PBS洗滌;加入Hoechst 33258染色液染色5 min;PBS洗滌;滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細(xì)胞的蓋玻片，使細(xì)胞生長面接觸封片液。熒光顯微鏡調(diào)節(jié)激發(fā)波長在350 nm左右，發(fā)射波長在460 nm左右，觀察細(xì)胞核形態(tài)并拍照記錄。

1.4 Western Blot觀察細(xì)胞Bax/Bak、P53的表達(dá)收集藥物處理3 d的細(xì)胞，PBS漂洗，加入蛋白提取緩沖 液 (Tris-HCl，pH 7.4;150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1%Triton，0.1%SDS，5 mg/L Leupeptin，1 mmol/L PMSF)裂解細(xì)胞，離心收集蛋白。蛋白定量采用 BCA(Bicinchoninic acid)(PIERCE，USA)法。上樣50 μg蛋白進(jìn)行 SDS-PAGE電泳。然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF(聚偏氟乙烯)膜上。5%脫脂奶粉封閉2 h，加入抗兔多克隆抗體Bak、P53，抗鼠單克隆抗體Bax、β-actin(Santa Cruz，USA)4 ℃孵育過夜，經(jīng)PBST洗滌后再加入相應(yīng)濃度的二抗(PIERCE，USA)室溫孵育2 h，洗滌后在暗室中加ECL(PIERCE，USA)檢測試劑，用 X線片曝光，顯影，定影。

2 結(jié)果

2.1 不同實驗組A549細(xì)胞生長和形態(tài)變化 藥物處理3 d后，倒置顯微鏡下觀察可見細(xì)胞和溶劑對照組及1 μmol/L ATRA組A549細(xì)胞密度大，生長旺盛，光澤度好(如圖1A～C);5 μmol/L ATRA組細(xì)胞密度減小，無堆疊生長，但形態(tài)改變不明顯(如圖1D);1 μmol/L 和5 μmol/L 4-HPR 組細(xì)胞數(shù)量明顯減少，生長稀疏，光澤度下降，細(xì)胞變小變圓，失去正常生長，高濃度組現(xiàn)象更明顯(如圖1E、F)。與前期研究［2］MTT實驗結(jié)果相吻合。

2.2 不同實驗組誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡 不同濃度藥物處理3 d后，行Hoechst染色檢測細(xì)胞凋亡情況。顯微鏡下可見1 μmol/L ATRA組(如圖2C)細(xì)胞核與對照組(如圖2A、B)區(qū)別不大;5 μmol/L ATRA組(如圖2D)細(xì)胞核數(shù)目相比對照組減少，有凋亡小體出現(xiàn);1 μmol/L 4-HPR 和 5 μmol/L 4-HPR處理組(如圖2E、F)細(xì)胞核數(shù)目較對照組明顯減少，細(xì)胞核致密濃染或碎裂，折光性增強，高濃度組更明顯。與我們前期研究［2］流式細(xì)胞術(shù)檢測調(diào)亡的結(jié)果相吻合。

2.3 不同實驗組對A549細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 收集藥物處理3 d的A549細(xì)胞，提取蛋白后行Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況。從圖3 可以看出，1 μmol/L 4-HPR 和5 μmol/L 4-HPR處理組促凋亡蛋白Bax/Bak的表達(dá)增加;轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子P53表達(dá)亦增加，并隨藥物濃度的提高而顯著增強。1 μmol/L ATRA組蛋白表達(dá)變化不明顯，5 μmol/LATRA組促凋亡蛋白Bax/Bak以及P53的表達(dá)亦增加。

3 討論

肺腺癌在各類肺癌中約占20% ～30%，女性病人多見，男性亦有增多趨勢，發(fā)病年齡較小，早期一般沒有明顯臨床癥狀，易發(fā)生早期轉(zhuǎn)移，病死率較高。對放療不敏感，化療仍是其目前主要治療方法。4-HPR是ATRA衍生物之一，與其他維甲酸類化合物相比其毒性小，在臨床上已經(jīng)成為非常有潛力的癌癥預(yù)防藥物［3］。它能抑制多種類型的腫瘤細(xì)胞增殖，包括頭頸鱗癌［3］、肺癌［4］、乳腺癌［5］等。本課題組前期實驗［2］和現(xiàn)階段研究均顯示其有明顯的抑制肺腺癌A549細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡的作用?？拱┐俚蛲鰴C制目前仍不清楚。有報道顯示4-HPR誘導(dǎo)一些類型的頭頸部鱗癌和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的凋亡，不能被抗氧化劑和 RAR特異阻斷劑所抑制［1］。前期研究［2］顯示其誘導(dǎo)凋亡與抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xS/L表達(dá)下降相關(guān)，提示4-HPR誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡機制可能與Bcl-2家族相關(guān)。Bcl-2家族蛋白位于線粒體信號通路上游，對線粒體誘導(dǎo)的凋亡具有重要的調(diào)節(jié)作用［6］。根據(jù)Bcl-2家族蛋白在細(xì)胞凋亡中的功能分為兩類，一類是抗凋亡的，如:Bcl-2、Bcl-xS/L等;一類是促進(jìn)凋亡的，如 Bax、Bak等。Bax/Bak位于胞漿，激活后轉(zhuǎn)位到線粒體膜上，能夠在線粒體外膜形成同源聚合物，促進(jìn)凋亡因子的釋放，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Bcl-2、Bcl-xS/L通過與促凋亡蛋白形成異源二聚物抑制Bax/Bak的活化。本次實驗Western Blot檢測Bax/Bak蛋白表達(dá)顯示:藥物作用同時，促凋亡蛋白Bax/Bak表達(dá)增多。驗證了之前的推論。

本次研究亦觀察到P53蛋白表達(dá)在4-HPR誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡過程中顯著提高。P53是抑癌基因p53表達(dá)的蛋白，與細(xì)胞周期的調(diào)控、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡等重要生物學(xué)功能有關(guān)。相關(guān)報道指出山楂酸誘導(dǎo)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞凋亡是通過激活P53促發(fā)線粒體相關(guān)凋亡通路，伴有Bax表達(dá)增加和Bcl-2表達(dá)減少［7］;生長抑素誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞凋亡的同時伴隨Bax的高表達(dá)，P53和Bcl-2的低表達(dá)［8］;國內(nèi)亦有研究指出4-HPR在體內(nèi)外抑制肝癌細(xì)胞增殖的過程中，出現(xiàn)P53過表達(dá)和Bcl-2/Bax表達(dá)比率下降［9］。以上均提示4-HPR誘導(dǎo)肺腺癌A549細(xì)胞凋亡可能依賴P53的Bcl-2家族通路來發(fā)揮作用。

ATRA是4-HPR的前體，在研究中作為對照藥物，對于該藥體外抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡和作用機制一并進(jìn)行了探討。相繼研究結(jié)果表明［2，10］，高濃度組(5 μmol/L)有較弱抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡的作用，凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平亦有一定改變。綜合國內(nèi)外報道［11，12］，考慮 ATRA 對 A549 細(xì)胞作用可能以促進(jìn)分化為主。

總之，4-HPR通過上調(diào)Bax/Bak的表達(dá)促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡，P53參與該藥物作用的信號通路，凋亡作用機制的進(jìn)一步闡明，將為肺腺癌病人的治療提供新思路。

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