朱惠霞 陶興林 胡立敏

（甘肅省農業(yè)科學院蔬菜研究所，甘肅蘭州 730070）

有關十字花科細胞質雄性不育的細胞學研究，目前已在油菜、白菜、蘿卜上有深入的報道（余鳳群和傅廷棟，1990；謝潮添 等，2004；聶明建 等，2007；劉靜 等，2008；田如霞 等，2010），研究認為敗育方式主要有無花粉囊型、花粉母細胞敗育型和單核花粉敗育型3種，而敗育的時期從造孢細胞到三核花粉的各個時期均可發(fā)生。本試驗的花椰菜（Brassica oleraceaL. var.botrytisL.）細胞質雄性不育系09-R9，是以從北京華耐公司引進的白靈作為母本，與甘肅省農業(yè)科學院蔬菜研究所花椰菜課題組原有自交系24進行回交轉育，到2009年已轉育6代，不育性遺傳穩(wěn)定，不育株率100%，不育度100%。通過對該不育系花藥發(fā)育細胞學形態(tài)進行觀察，并與其他十字花科細胞質不育材料進行比較，分析不育系09-R9的花藥敗育時期和發(fā)育特點，為探索花椰菜細胞質雄性不育機理提供基礎資料，為今后將該不育系應用于生產實踐提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為花椰菜細胞質雄性不育材料 09-R9及其相應的可育材料 24，2008年 11月 25日播種育苗，2009年3月17日定植于本所塑料大棚，每品種1小區(qū)，不設重復，常規(guī)管理。石蠟切片、顯微觀察等在本所實驗室內進行。

1.2 方法

2009年7月5日取樣，采摘可育株及不育株主花序上不同大小花蕾，用游標卡尺測量長度，參考楊光圣等（1999）對正常油菜的花藥發(fā)育劃分方法，取不同長度花蕾的正?；ㄋ庣R檢確定發(fā)育時期。將其分為孢原細胞時期、造孢細胞時期、花粉母細胞減數分裂至四分體時期、單核花粉期、花粉成熟期。

將不同發(fā)育時期的花蕾分別用卡諾液（無水乙醇∶冰醋=3V∶1V）固定24 h后，用梯度酒精（70%、80%、90%、95%、100%）脫水，梯度二甲苯（2/3純酒精+1/3二甲苯、1/2純酒精+1/2二甲苯、1/3純酒精+2/3二甲苯、二甲苯）透明，按常規(guī)切片程序包埋，旋轉式切片機切片，切片厚度為5μm，鐵礬-蘇木精染色，加拿大樹膠封藏，OLYMPUS顯微鏡觀察并照相。

2 結果與分析

2.1 花椰菜可育株花藥發(fā)育的細胞學觀察

在花椰菜可育株雄蕊發(fā)育過程中，花藥的橫切面呈蝶型，有發(fā)育正常的4個花粉囊。當花蕾長約1.0 mm時，花藥的4個角隅處已形成清晰的藥室，藥室壁層染色較深（圖Ⅰ-1），藥室放大后可以看出，花粉母細胞的體積較大，呈多邊形，細胞核大，染色深（圖Ⅰ-2）。隨著發(fā)育進程的推進，花粉母細胞漸近圓形，并進行減數分裂，產生的四分體被一層胼胝質包圍（圖Ⅰ-3、4），此后胼胝質開始解體，四分孢子從中釋放出來，剛分離出來的小孢子外形不規(guī)則，但很快變成圓形或近圓形，成為單核花粉粒，在此發(fā)育過程中，絨氈層細胞逐漸向內收縮，在即將成熟的花藥中，絨氈層逐步解體，位于花藥隔同一側的相鄰的2個囊逐漸靠近（圖Ⅰ-5），形成成熟花粉粒，花粉粒染色很深（圖Ⅰ-6）。開花前，組成花藥壁的細胞只?；ㄋ幈砥ず屠w維層兩層，這2個囊將打通成1個共同的藥室將花粉散放出來。

圖版Ⅰ 正?；ㄒ嘶ㄋ幇l(fā)育過程

2.2 花椰菜不育株花藥發(fā)育的細胞學觀察

對花椰菜細胞質雄性不育系09-R9花藥的細胞學觀察結果表明，在花蕾長1.0 mm時，花藥的形狀很不規(guī)則，大小各不相同，有的花藥形成4個外形正常的花粉囊（圖Ⅱ-1），有的形成1個或2個花粉囊，其他位置始終保持薄壁狀態(tài)，未分化出花粉囊。與同時期的可育花藥相比，明顯發(fā)現不育花藥的藥室內并未形成正常的花粉母細胞，且花粉囊壁染色較深，結構異常（圖Ⅱ-2）。在應該發(fā)育到四分體時期時，花粉囊逐漸變形，囊壁變薄，囊內物質解體（圖Ⅱ-3、4），到花粉粒成熟前，花粉囊也逐步解體（圖Ⅱ-5），至開花前已經完全解體，子房膨大，只留下一部分殘壁染色較深、干癟的花藥（圖Ⅱ-6），且相鄰兩花粉囊的藥隔組織消失。

圖版Ⅱ 花椰菜細胞質雄性不育系09-R9花藥敗育過程

3 討論

本試驗所用的細胞質雄性不育材料，花藥會形成部分外形正常花粉囊，但花粉母細胞解體，且囊內的物質隨著花藥的發(fā)育逐漸解體，最終所有的花粉囊也都解體，直至溶解消失，這一結果與田如霞等（2010）研究的春蘿卜雄性不育系敗育的結果十分相似，即花粉囊最終降解消失，只留下干癟的花藥，但二者敗育的時期并不相同，春蘿卜的敗育發(fā)生在單核靠邊期，而本試驗所用的花椰菜細胞質雄性不育系09-R9敗育發(fā)生在花粉母細胞時期，這與聶明建等（2007）研究的甘藍型油菜細胞質雄性不育系392A的敗育時期和方式一致。本試驗中花藥敗育的切片結果與劉靜等（2008）研究的蘿卜花蕾敗育的過程十分相似，不同之處在于蘿卜不育系每個花藥可以形成4個花粉囊，而本試驗的不育系花藥形成的花粉囊為2～4個各不相等。

前人的研究結果都表明花粉的敗育與絨氈層的發(fā)育有著特殊的重要作用。周巍和許明（2007）認為，因為絨氈層最靠近花粉母細胞，花粉母細胞所需營養(yǎng)都是其供給的，絨氈層發(fā)生異常，就必然會引起花粉母細胞的發(fā)育異常。本試驗中觀察不育材料切片發(fā)現，在相當于花粉母細胞時期，細胞質雄性不育系09-R9的花粉囊內無絨氈層，可能是本身并未形成正常的絨氈層，這與聶明建等（2007）研究的甘藍型油菜細胞質不育系392A在高溫條件下未形成絨氈層的結果一致。

劉靜，張魯剛，王風敏.2008.蘿卜花蕾敗育過程中的組織細胞學特征觀察.西北農業(yè)學報，17（5）：272-276.

聶明建，王國槐，朱衛(wèi)平.2007.甘藍型油菜3種類型雄性不育系花藥敗育的細胞學研究.中國農業(yè)科學，40（7）：1543-1549.

田如霞，武玲萱，崔貴梅.2010.春蘿卜雄性不育系4205A小孢子敗育的細胞學觀察.華北農學報，25（6）：109-112.

謝潮添，楊延紅，朱學藝，田惠橋.2004.白菜細胞核雄性不育花藥的細胞化學觀察.實驗生物學報，37（4）：295-301.

楊光圣，矍波，傅廷棟.1999.三個甘藍型油菜隱性核不育系小孢子發(fā)生的細胞學研究.華中農業(yè)大學學報，18（6）：520-523.

余鳳群，傅廷棟.1990.甘藍型油菜幾個雄性不育系的細胞形態(tài)學研究.武漢植物學研究，（3）：119-216.

周巍，許明.2007.不結球白菜細胞核雄性敗育過程的細胞學研究.安徽農業(yè)科學，35（6）：1600-1601.