翟 文 林良斌 李石開 丁建明 汪 騫 程 鋒 王曉武武 劍*

（1云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201；2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081；3云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所，云南昆明 650205；4東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150030）

作物正常生長發(fā)育依賴于養(yǎng)分的充足供應(yīng)，而氮肥作為大量使用的元素是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中重要的增產(chǎn)因子之一（Masclaux-Daubresse et al.，2010），隨著氮肥用量的不斷增加，在提高產(chǎn)量的同時(shí)，傳統(tǒng)的蔬菜施肥管理模式容易造成生產(chǎn)成本增加、水肥浪費(fèi)、土壤養(yǎng)分比例失調(diào)、蔬菜硝酸鹽累積、地下水資源嚴(yán)重污染等一系列問題（Loudet et al.，2003），這些問題越來越受到人們的關(guān)注。關(guān)聯(lián)作圖是一種利用連鎖不平衡（Linkage disequilibrium，LD）檢測自然群體中基因位點(diǎn)及其等位變異的方法。關(guān)聯(lián)分析曾經(jīng)被廣泛應(yīng)用于人類遺傳學(xué)（March，1999），目前關(guān)聯(lián)分析已應(yīng)用于玉米、水稻、擬南芥等植物關(guān)于氮利用效率的遺傳研究（Flint-Garcia et al.，2005；Atwell et al.，2010；Huang et al.，2010），但在蔬菜的氮利用上還鮮見報(bào)道。

白菜類作物是我國重要的栽培蔬菜，其生長迅速、生長期短、產(chǎn)量高、需肥量較大，生產(chǎn)中氮肥用量過大是一個(gè)普遍存在的問題。本試驗(yàn)以 160份有代表性的白菜類作物品系組成的自然群體為試材，找出其優(yōu)異位點(diǎn)和相應(yīng)的等位變異，進(jìn)而發(fā)掘出具有優(yōu)異等位變異的載體品種，提高白菜類作物的氮利用效率，改善氮肥利用、解決氮素?fù)p失問題。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取不同來源的160份白菜類作物種質(zhì)材料組成一個(gè)具有廣泛代表性的自然群體，包括23份蕪菁、62份蔬菜類型、75份油用類型。

1.2 試驗(yàn)方法

2009年10月在云南省昆明市西山區(qū)選取相對貧瘠的土地播種146份材料，均勻隨機(jī)地在10個(gè)地點(diǎn)選取土樣檢測，pH值7.15，有機(jī)質(zhì)含量46.36 mg·kg-1，氮百分比含量為0.229，符合標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)要求。隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，2個(gè)氮水平處理：26 g·m-2和0 g·m-2，分別用N+和N-表示，每處理3次重復(fù)，每重復(fù)6株1小區(qū)，每小區(qū)選取長勢均一的3株調(diào)查表型性狀，在播種后80 d測量株高、葉片數(shù)、葉長、葉寬、葉面積、單葉質(zhì)量；每小區(qū)選取1株在播種后80 d測量生物總量，播種后180 d測量生物總量、種子產(chǎn)量和氮含量。

2010年10月在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所玻璃溫室內(nèi)進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，播種158份材料，選用氮素含量很低的草炭、蛭石（1V∶1V）為基質(zhì)，pH為5.5～5.9，硝態(tài)氮（NO3-）含量為34.6 mg·kg-1。每周用營養(yǎng)液（Loudet et al.，2003）澆灌，2個(gè)氮水平處理：10 mmol·L-1（N+）和3 mmol·L-1（N-）。氮總投入量分別是正常氮（N+）：KNO3-0.88 g·株-1、CaNO3-1.03 g·株-1；低氮（N-）：KNO3-0.35 g·株-1、CaNO3-0.21 g·株-1，每處理4次重復(fù)。播種后50 d測量株高、葉片數(shù)、單葉質(zhì)量、葉長、葉寬、葉面積和開展度。

株高為植株最高的營養(yǎng)生長葉片的位置到根部以上的長度；開展度為地上部分所形成的最大寬度；總生物量為植株地上部和地下部的生物總量；葉片形態(tài)取植株從外到內(nèi)第 3片真葉掃描，稱取葉片的單葉質(zhì)量，使用 LA-S全能型植物圖像分析系統(tǒng)軟件分析掃描的圖片，測量葉長、葉寬、葉面積；用于掃描的葉片烘干送云南農(nóng)業(yè)大學(xué)環(huán)境科學(xué)實(shí)驗(yàn)室檢測氮含量，檢測方法為H2SO4混合加速劑蒸餾法（魯如坤，2000）。

1.3 表型性狀的遺傳變異及相關(guān)性分析

采用SPSS 10.0軟件對各性狀進(jìn)行基本的統(tǒng)計(jì)分析，用每份材料均值進(jìn)行不同氮處理之間各性狀方差分析（ANOVA）。

式中，TN+表示正常供氮條件下的性狀均值，TN-表示低氮脅迫下的性狀均值。

1.4 InDel標(biāo)記全基因組掃描

選取苗期的幼嫩葉片，用抽真空冷凍干燥機(jī)干燥，研磨至粉末狀保存。DNA提取方法參照改良CTAB法（Pritchard et al.，2000），隨機(jī)選取8份材料為篩選引物的樣本，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室提供的分布于白菜基因組10條染色體的500對InDel標(biāo)記進(jìn)行引物篩選，選擇多態(tài)性較好、基因組分布均勻的178對引物進(jìn)行群體基因分型。InDel反應(yīng)體系（20 uL）：15 ng·μL-1模板 DNA 5 μL，2.5 U·μL-1Taq酶 0.4μL，10×buffer 2.0 μL，5 pmoL·μL-1上游引物 0.4 μL，5 pmoL·μL-1下游引物 0.4 μL，2.5 mmol·μL-1dNTP 1.6 μL，ddH2O 10.4 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性40 s，57 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min；16 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

1.5 連鎖不平衡（LD）的衡量與群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

使用標(biāo)準(zhǔn)不平衡系數(shù)（D'）衡量位點(diǎn)間 LD（Flint-Garcia et al.，2003），應(yīng)用Edward Buckler Lab開發(fā)的軟件包TASSEL計(jì)算LD配對檢測的矩陣圖，用于觀測共線及非共線標(biāo)記之間的LD排列。

應(yīng)用STRUCTURE軟件（Pritchard et al.，2000）對白菜類作物自然群體做群體結(jié)構(gòu)分析。使用混合模型群體數(shù)目（K值）從 2～8模擬群體結(jié)構(gòu)，并假定全部 207個(gè)變異位點(diǎn)都是獨(dú)立的。MCMC（Markov Chain Monte Carlo）設(shè)置10萬次迭代，初始burn-in次數(shù)為10萬?；跀?shù)學(xué)模型確定群體分組和個(gè)體分配，并計(jì)算相應(yīng)的Q值。

觀察組治療后TNF-α、IL-1、SOD、MDA、NT-proBNP較對照組明顯改善,兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

1.6 關(guān)聯(lián)分析

采用 TASSEL2.0軟件（Abdurakhmonov & Abdukarimov，2008）的 GLM（General Linear Model）程序，以各Q值作為協(xié)變量進(jìn)行群體矯正，將10個(gè)性狀的表型數(shù)據(jù)分別與標(biāo)記變異進(jìn)行回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氮處理下表型性狀的遺傳變異

兩年統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1所示，160份種質(zhì)材料（包括11個(gè)亞種或變種：蕪菁、白菜型油菜、結(jié)球白菜、普通白菜、菜薹、意大利菜心、紫菜薹、烏塌菜、黃籽沙遜油菜、水菜、Komatsuna）各亞種或變種之間除了氮含量外其余性狀差異達(dá)顯著或極顯著水平。

2009年云南大田試驗(yàn)中，不同氮處理之間，除了株高和葉片數(shù)外，其他各性狀在施氮（N+）和不施氮（N-）條件下呈極顯著性差異，且施氮處理的植株生長狀況優(yōu)于不施氮處理；株高和葉片數(shù)差異不顯著可能是相對受氮處理水平影響較小，受環(huán)境影響較大。雖然在氮脅迫條件下各表型性狀都有一定程度的降低，但各性狀受低氮脅迫影響的程度不一樣，其中生物量、單葉質(zhì)量和種子產(chǎn)量降低的幅度較大，氮敏感指數(shù)較高。低氮脅迫下，80 d生物總量和180 d生物總量平均值分別為39.83 g和242.03 g，比正常供氮水平降低了29.12%和29.67%；種子產(chǎn)量均值55.18 g，比正常供氮水平降低了29.17%；單葉質(zhì)量均值4.15 g，比正常供氮水平降低了17.66%。

2010年北京盆栽試驗(yàn)中，單葉質(zhì)量降低最明顯，均值為 1.93 g，比正常供氮水平降低了24.61%；其次是葉面積，均值為49.00 cm2，比正常供氮水平降低了21.23%。由于后期生長勢較弱，盆栽試驗(yàn)沒有調(diào)查后期生物量和種子產(chǎn)量等性狀。

表1 不同氮處理下白菜類作物的表型性狀

2.2 InDel標(biāo)記位點(diǎn)之間的連鎖不平衡與群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

10條染色體上207個(gè)InDel位點(diǎn)的21 321種兩兩位點(diǎn)組合中，不論共線性組合，還是非共線性組合，連鎖不平衡均不明顯。得到統(tǒng)計(jì)概率支持的不平衡成對位點(diǎn)比例少，占總位點(diǎn)組合的7.02%；不平衡程度D'＞0.5的組合數(shù)占總位點(diǎn)組合的17.75%。共線InDel位點(diǎn)D'值隨遺傳距離增加有明顯的衰減。群體結(jié)構(gòu)分析表明，樣本的等位變異頻率特征類型數(shù) K=5，即樣本亞群體的數(shù)目為5。

2.3 與表型性狀顯著相關(guān)的等位變異

對2009年云南大田試驗(yàn)調(diào)查的10個(gè)表型性狀以及2010年北京盆栽試驗(yàn)調(diào)查的7個(gè)性狀與標(biāo)記進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，標(biāo)記貢獻(xiàn)率均大于0.04，云南和北京的試驗(yàn)分別檢測出45個(gè)和35個(gè)顯著性相關(guān)的標(biāo)記，其中4個(gè)標(biāo)記為同一性狀兩年共定位，平均貢獻(xiàn)率為0.06（表2）。

表2 部分重要的顯著相關(guān)性位點(diǎn)及其對白菜類作物表型變異的貢獻(xiàn)率

續(xù) 表

續(xù) 表

從性狀間比較來看，同一位點(diǎn)多個(gè)性狀相關(guān)聯(lián)情況很普遍，關(guān)聯(lián)到2個(gè)以上性狀的變異位點(diǎn)共有24個(gè)，在染色體A03上有5個(gè)性狀共定位到10ID1046標(biāo)記，有3個(gè)性狀共同定位到A07染色體的09ID10109標(biāo)記，有可能是一因多效的遺傳基礎(chǔ)。

株高共檢測到33個(gè)在不同氮水平下顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，其中N+條件下17個(gè)，在N-條件下有16個(gè)，其中貢獻(xiàn)率最高的位點(diǎn)是 N-的 09ID10091。ID10581兩年都只在 N+條件下檢測到，10ID10253位點(diǎn)株高和葉片數(shù)在N+條件下共定位，10ID101209在N+條件下被檢測到與5個(gè)性狀相關(guān)聯(lián)，說明這些位點(diǎn)與氮充足條件下表達(dá)，而在氮脅迫條件下被抑制的某些基因有關(guān)。

葉片數(shù)共檢測到26個(gè)顯著性位點(diǎn)，N+條件下有15個(gè)，N-條件下有11個(gè)，其中ID101227在兩年都被定位到，2009年云南大田試驗(yàn)在兩個(gè)氮水平都有定位，平均貢獻(xiàn)率高達(dá)0.16，而且與葉面積、葉寬共定位。說明其是植物葉片數(shù)目和植物形態(tài)生長非常關(guān)鍵的位點(diǎn)。

葉長共檢測到14個(gè)顯著性位點(diǎn)，N+條件下有7個(gè)，N-條件下有7個(gè)，最高貢獻(xiàn)率的位點(diǎn)是N-條件下的09ID10255，而且這個(gè)位點(diǎn)在N-水平下在葉面積、單葉質(zhì)量和總生物量中都被檢測到，10ID10487也在葉面積中N-條件下被檢測到，說明這兩個(gè)位點(diǎn)存在氮脅迫條件下高表達(dá)的基因，有可能是控制氮利用效率的關(guān)鍵基因。

葉寬共檢測到13個(gè)顯著性位點(diǎn)，N+條件下有6個(gè)，N-條件下有7個(gè)；葉面積共檢測到15個(gè)位點(diǎn)，N+條件下有5個(gè)，N-條件下有10個(gè)，兩個(gè)性狀貢獻(xiàn)率最高的位點(diǎn)都是09ID10715，并且都是在N+條件下。說明這個(gè)位點(diǎn)在氮充足的情況下控制葉片的形態(tài)生長。

種子產(chǎn)量共檢測到9個(gè)顯著性位點(diǎn)，N+條件下有4個(gè)，N-條件下有5個(gè)，貢獻(xiàn)率最高的是位于A03染色體上的09ID10295（N+）和位于A07染色體上的09ID10109（N-），09ID10109也檢測到與葉長（N-）和總生物量（N+和 N-）顯著關(guān)聯(lián)，在 N-條件下的貢獻(xiàn)率高于在 N+條件下。因此推測這個(gè)位點(diǎn)存在可能在氮脅迫條件下高效表達(dá)的基因，并影響著植物生物量、繁殖能力和植株形態(tài)等多個(gè)性狀，值得進(jìn)一步的研究和分析。

3 討論

群體結(jié)構(gòu)指的是一個(gè)群體內(nèi)存在亞群的情況，亞群的混合、自然和人為的選擇使整個(gè)群體所估計(jì)的連鎖不平衡（LD）強(qiáng)度增強(qiáng)，可能導(dǎo)致基因多態(tài)性位點(diǎn)與性狀的相關(guān)性并非由功能性等位基因引起，從而顯現(xiàn)假陽性結(jié)果（Gupta et al.，2005）。因此，進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析前對群體進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析和調(diào)節(jié)是必要的。

本試驗(yàn)基于少量分子標(biāo)記（207個(gè)位點(diǎn)），只是粗略意義上的全基因組關(guān)聯(lián)分析，目的在于為即將開展的候選基因關(guān)聯(lián)作圖做好鋪墊。嚴(yán)格意義上的全基因組關(guān)聯(lián)分析需使用高密度標(biāo)記對全基因組進(jìn)行掃描。特別是對于白菜類這種常異交植物，LD衰減的距離較短（相對于自花授粉作物擬南芥、水稻、小麥等來說），所需的標(biāo)記數(shù)量更多。

QTL定位方法比較多，本試驗(yàn)所采用關(guān)聯(lián)分析方法，應(yīng)用TASSEL軟件的GLM程序檢測表型變異與InDel位點(diǎn)關(guān)聯(lián)的顯著性，由于不依賴于遺傳圖譜進(jìn)行QTL分析，比較簡單直觀，可以對作物群體一個(gè)基因座的多個(gè)變異位點(diǎn)進(jìn)行分析，且對QTL的檢測能力較高。然而該方法的缺陷是不能估計(jì)QTL的具體位置及其加性、上位性效應(yīng)。

基因之間的相互關(guān)聯(lián)和相互影響，會(huì)隨著環(huán)境的壓迫和代謝的變化，使一些特殊基因表達(dá)可能受到抑制（Kusano et al.，2011），正常氮水平下，為了促進(jìn)細(xì)胞的分裂和增長，植物基因表達(dá)量較多，因此植物葉面積增長快，能有更多的葉面積用來進(jìn)行光合作用，植物生命活動(dòng)旺盛，基因的表達(dá)和代謝都較豐富。由于氮是植物生命活動(dòng)的必須元素，在N-處理后，出現(xiàn)了一系列分子水平的變化（DNA、RNA、蛋白和代謝），頂端分生組織生長也減緩，某些作為轉(zhuǎn)錄因子的基因家族（LBD37/ASL39，LBD38/ALS40和LBD39/ASL41）的表達(dá)水平也有所減弱，以維持在低氮環(huán)境植物的生存（Rubin et al.，2009；Tschoep et al.，2009），這就能解釋為什么在N+條件下檢測到的顯著性關(guān)聯(lián)位點(diǎn)要比 N-條件下要多，而在 N-條件下還能檢測到一些特殊的顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，這些位點(diǎn)上的相關(guān)基因可能就是與氮吸收利用效率有關(guān)的，在氮脅迫的條件下保證植物的生長。

選育氮高效利用的白菜類品種是減少氮肥施用量、降低生產(chǎn)成本和環(huán)境污染的一種有效途徑，但由于氮素利用涉及到多個(gè)性狀，并且表現(xiàn)出典型的數(shù)量性狀遺傳，利用常規(guī)育種方法選擇的難度較大，本試驗(yàn)鑒定了一批與氮高效利用有關(guān)的QTL位點(diǎn)，有助于利用分子標(biāo)記輔助選擇氮素利用效率。

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