李 園 張大燕 徐文元 郭美霞 曹坳程

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京100193）

枯萎病主要危害番茄（Lycopersicum esculentumMill.）、辣椒等作物的莖部維管束。發(fā)病初期，植株中、下部葉片在中午時(shí)呈褐色萎蔫，早晚恢復(fù)正常；隨病害發(fā)展，植株中、上部更多葉片開始發(fā)病萎蔫，但不脫落；至最后全株葉片萎蔫發(fā)黃，整株枯死。病癥有時(shí)僅出現(xiàn)在莖的一邊，或一片葉一邊發(fā)黃而另一邊正常。剖視莖、葉柄及果柄，可見其維管束均呈褐色。潮濕環(huán)境下，病株莖基部產(chǎn)生粉紅色霉（黃紹崗，1994；徐艷輝 等，2008）。病程進(jìn)展較慢，15～30 d才枯死，無乳白色黏液流出，有別于青枯病。發(fā)病率15%～20%，嚴(yán)重時(shí)植株全部枯死，對(duì)產(chǎn)量造成很大的損失（程愛昀，2010）。本試驗(yàn)對(duì)北京平谷地區(qū)的番茄枯萎病病株進(jìn)行分離、純化，運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)病原菌進(jìn)行診斷鑒定，以期為防治番茄枯萎病提供參考。

1 材料與方法

1.1 番茄枯萎病病組織采集

2010年 12月于北京市平谷區(qū)溫室進(jìn)行樣品采集，主要采集番茄病株的莖、葉部分 5～10株，將所采集的番茄病組織（圖1）保存于4 ℃ 冰箱備用。

圖1 供試番茄枯萎病病組織

1.2 番茄枯萎病病原分離與鑒定

采用PDA+S培養(yǎng)基對(duì)采集到的番茄枯萎病病原菌進(jìn)行分離。培養(yǎng)基成分：1 000 mL滅菌水，38 g馬鈴薯葡萄糖瓊脂，5 g瓊脂，0.05 g硫酸鏈霉素。病原菌的分離培養(yǎng)采用常規(guī)組織分離法，從病株根部切下3 mm×3 mm×1 mm的小塊，放入70%酒精消毒30 s，然后轉(zhuǎn)入1%次氯酸鈉溶液浸泡2 min，用無菌水清洗3次，置于PDA+S培養(yǎng)基上，在25 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫培養(yǎng)7 d（鄭莉 等，2006）。培養(yǎng)皿內(nèi)觀察病菌形態(tài)。

1.3 菌絲體收集及DNA提取

在無菌操作臺(tái)上，用刀片輕輕刮下培養(yǎng)皿中病原菌菌絲，并將其收集至 EP管中。采用TakaRa試劑盒進(jìn)行DNA提取。

1.4 PCR鑒定

PCR 反應(yīng)體系（50 μL）：5 U·μL-1Taq酶 0.25 μL，10×PCR buffer（Mg2+plus）5 μL；2.5 mmol·L-1dNTP Mixture 4 μL；10 ng模板 DNA 1 μL；10 μmol·L-1ITS1/ITS4引物各 1 μL；滅菌雙重蒸餾水補(bǔ)足至50 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 mim；95 ℃變性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)，電壓85 V，電泳時(shí)間30 min，Bio-rad凝膠成像儀進(jìn)行觀測(cè)、拍照。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)在GeneBank中進(jìn)行Blast （http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）序列比對(duì)，分析序列同源性。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄枯萎病病原菌

如圖2所示，對(duì)采集到的番茄枯萎病病原進(jìn)行分離培養(yǎng)后得到的菌落呈圓形，菌絲細(xì)絨狀，蓬松。菌落呈白色或邊緣白色，向內(nèi)逐漸變成粉紅色。

圖2 番茄枯萎病病原菌菌落

對(duì)番茄枯萎病病原菌菌落進(jìn)行顯微鏡鏡檢，該病原菌大型分生孢子鐮刀形，無色，彎曲，2～5個(gè)隔膜，多數(shù)為3個(gè)隔膜，大小為（19～45）μm×（2.5～5.0）μm，基部具足細(xì)胞；小型分生孢子橢圓形或卵形，無色，單孢或雙孢，大小為（5～26）μm×（2.0～4.5）μm；厚垣孢子球形，多數(shù)單孢，平滑或皺縮，頂生或間生。初步認(rèn)定該病原菌為鐮刀菌。

2.2 番茄枯萎病病原分子鑒定

番茄枯萎病病原 ITS-PCR鑒定結(jié)果如圖3所示，條帶大小為500～700 kb，清晰單一，PCR產(chǎn)物直接送華大基因公司進(jìn)行測(cè)序。

2.3 序列信息及比對(duì)結(jié)果

測(cè)序結(jié)果顯示，ITS序列全長(zhǎng)為538 bp，GeneBank中 Blast序列比對(duì)結(jié)果顯示，與尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）序列同源性高達(dá) 100%；另一份樣品測(cè)序結(jié)果顯示，ITS序列全長(zhǎng)為 534 bp，GeneBank中 Blast序列比對(duì)結(jié)果顯示，與串珠鐮刀菌（Fusarium proliferatum）序列同源性高達(dá)99%。

圖3 番茄枯萎病病原ITS-PCR鑒定結(jié)果

3 小結(jié)

經(jīng)過病原菌的分離純化、形態(tài)學(xué)觀察及分子生物學(xué)技術(shù)鑒定，初步結(jié)果表明北京市平谷地區(qū)番茄枯萎病主要由尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）侵染所致。另外也可能存在串珠鐮刀菌（Fusarium proliferatum）的復(fù)合侵染。

程愛昀.2010.大棚番茄枯萎病的診斷和防治新技術(shù).中國(guó)瓜菜，（1）：45-46.

黃紹崗.1994.番茄枯萎病及其防治方法.廣西植保，（3）：29-30.

徐艷輝，李燁，許向陽(yáng).2008.番茄枯萎病的研究進(jìn)展.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，39（11）：128-134.

鄭莉，朱秋珍，馮自立，黃俊斌.2006.草莓枯萎病病原菌鑒定及其生物學(xué)特性.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，45（2）：194-196.