段曉穎，高衛(wèi)芳，平佳宜，張輝（.河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥制劑三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，鄭州市 450000；.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，衛(wèi)輝市 45300）

愈潰生物黏附單向釋藥貼膜系由胡黃連、牡丹皮、青黛與冰片4味藥組成，具有清熱解毒、消腫散結(jié)、止痛、化腐生肌之功效，用于治療口腔潰瘍，療效顯著。該貼膜由具生物黏附性的載藥層和在口腔中不溶解的背襯層復(fù)合而成，使藥物僅向內(nèi)側(cè)釋放，減輕了藥物不適口味，增大了藥物濃度梯度，使藥物緩慢釋放吸收，達(dá)到了長(zhǎng)效及加快潰瘍面愈合的目的。為了更有效控制該產(chǎn)品的質(zhì)量，筆者對(duì)制劑中青黛、冰片、牡丹皮進(jìn)行了薄層色譜（TLC）鑒別，并采用高效液相色譜（HPLC）法對(duì)胡黃連中胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ進(jìn)行了含量測(cè)定。

1 儀器與試藥

LC-10A HPLC儀、AEL-200電子天平（日本島津公司）；CP225D電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）。

胡黃連苷Ⅰ（批號(hào)：111727-200501）、胡黃連苷Ⅱ（批號(hào)：111596-200301）、靛玉紅（批號(hào)：110717-200204）、芍藥苷（批號(hào)：0736-9913）、冰片（批號(hào)：110743-200303）對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；愈潰生物黏附單向釋藥貼膜（以下簡(jiǎn)稱愈潰貼膜，河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院制劑室自制，批號(hào)：091222、091212、091218、091228）；牡丹皮、冰片、胡黃連、青黛飲片（安徽亳州濟(jì)人藥業(yè)有限公司，批號(hào)分別為090306、090503、090306、090412）。

2 定性鑒別

2.1 牡丹皮的TLC鑒別

精密稱取芍藥苷對(duì)照品1.37mg，加乙醇1m L溶解，制成每1m L含1.37mg的溶液，作為對(duì)照品溶液；取本品50片（批號(hào)：091222），剪碎，加乙醇30m L，超聲30m in，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0m L使溶解，濾過(guò)，濾液用水飽和的正丁醇萃取3次（20、15、15m L），分別取正丁醇液，蒸干，殘?jiān)右掖?m L使溶解，加入0.5 g中性氧化鋁，拌勻，裝入預(yù)先裝好的中性氧化鋁柱（氧化鋁100～200目，內(nèi)徑10mm）頂部，以甲醇40m L洗脫，收集洗脫液，揮干，殘?jiān)右掖?.5m L使溶解，作為供試品溶液；取缺牡丹皮的處方藥材，按工藝制成缺牡丹皮陰性樣品，同法制備缺牡丹皮陰性對(duì)照溶液。照TLC法[1]試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各10μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶10∶0.2）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%的香草醛硫酸溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；陰性對(duì)照無(wú)干擾。牡丹皮的TLC見(jiàn)圖1。

2.2 青黛的TLC鑒別

精密稱取靛玉紅對(duì)照品0.91mg，加三氯甲烷制成每1m L含0.45mg的溶液，作為對(duì)照品溶液；取本品20片（批號(hào)：091222），剪碎，加三氯甲烷10m L，超聲30min，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液；取缺青黛的處方藥材，按工藝制成缺青黛陰性樣品，同法制成缺青黛陰性對(duì)照溶液。照TLC法[1]試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各10μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板板上，以甲苯-三氯甲烷-丙酮（5∶4∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，日光下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；陰性對(duì)照無(wú)干擾。青黛的TLC見(jiàn)圖2。

2.3 冰片的TLC鑒別

取冰片對(duì)照品2.0mg，加乙醇制成每1m L含2.0mg的溶液，作為對(duì)照品溶液；取本品20片（批號(hào)：091222），剪碎，加乙醚20 m L，密塞，冷浸30 m in，濾過(guò)，濾液揮干，殘?jiān)右掖? m L使溶解，作為供試品溶液；取缺冰片的處方藥材，按工藝制成缺冰片陰性對(duì)照，同法制備缺冰片陰性對(duì)照溶液。照TLC法[1]試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板板上，以石油醚（60～90℃）-苯-乙酸乙酯（9∶4∶2）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%的香草醛硫酸溶液，于105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；陰性對(duì)照無(wú)干擾。冰片的TLC見(jiàn)圖3。

圖1 牡丹皮的TLC 1.芍藥苷對(duì)照品；2.陰性對(duì)照；3～5.供試品Fig 1 TLC of Paeonia suffruticosa 1.paeoniflorin control；2.negative control；3～5.testsamples

圖2 青黛的TLC 1.靛玉紅對(duì)照品；2.陰性對(duì)照；3～5.供試品Fig 2 TLC of Indigo Naturalis 1.indirubin control；2.negative control；3～5.test samples

圖3 冰片的TLC 1.冰片對(duì)照品；2.陰性對(duì)照；3～5.供試品Fig 3 TLC of Borneolum Syntheticum 1.Borneolum Syntheticum control；2.negative sample；3.testsamples

3 含量測(cè)定

3.1 色譜條件

色譜柱：Agilent XDB-C18柱（150 mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-水-磷酸（35∶65∶0.1）；檢測(cè)波長(zhǎng)：275 nm；流速：1m L·min-1；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10μL。

3.2 混合對(duì)照品溶液的制備

精密稱取胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ?qū)φ掌?.01、5.02mg，置25m L容量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取此溶液1m L，置5m L量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得（每1m L中含胡黃連苷Ⅰ40.08μg、胡黃連苷Ⅱ40.16μg）。

3.3 供試品溶液的制備

取本品30片，剪碎，稱取0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50.0m L，密塞，稱定重量，超聲處理（功率：250W，頻率：50 kHz）30m in，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，取續(xù)濾液2.0m L置5m L容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

3.4 陰性對(duì)照溶液的制備

取缺胡黃連的陰性樣品，按“3.3”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

3.5 專屬性試驗(yàn)

精密吸取各對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液適量，按上述色譜條件測(cè)定。結(jié)果表明，胡黃連供試品色譜中，在與胡黃連苷Ⅰ和胡黃連苷Ⅱ?qū)φ掌飞V相同保留時(shí)間處有色譜峰出現(xiàn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾。色譜見(jiàn)圖4。

圖4 高效液相色譜圖A.對(duì)照品；B.供試品；C.陰性對(duì)照；1.胡黃連苷Ⅱ；2.胡黃連苷ⅠFig 4 HPLC chromatograms A.substance control；B.testsample；C.negative control；1.picrosidⅡ；2.picrosideⅠ

3.6 線性關(guān)系考察

精密吸取混合對(duì)照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0m L，置5m L容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成對(duì)照品溶液。分別精密吸取上述溶液各10μL，按上述色譜條件測(cè)定。以峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，檢測(cè)濃度（X，μg·m L-1）為橫坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ的回歸方程分別為Y胡黃連苷Ⅰ＝2 408 171.25X胡黃連苷Ⅰ+5 921.7（r＝0.999 9）；Y胡黃連苷Ⅱ＝977 847.69X胡黃連苷Ⅱ+1 007.00（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ的檢測(cè)濃度分別在0.08～0.40、0.12～0.60μg·m L-1范圍內(nèi)與各自峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

3.7 精密度試驗(yàn)

分別吸取混合對(duì)照品溶液10μL，按上述色譜條件測(cè)定，重復(fù)進(jìn)樣5次。結(jié)果，胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ峰面積的RSD分別為0.40%、0.28%（n均為5），表明儀器精密度良好。

3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密量取同一供試品溶液10μL，在室溫下放置0、1、2、4、6、8、12、16、20、24 h，按上述色譜條件測(cè)定。結(jié)果，胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ峰面積的RSD分別為1.01%、1.47%（n均為10），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.9 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批樣品（批號(hào)：091228）6份，各約0.2 g，精密稱定，按“3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照上述色譜條件測(cè)定。結(jié)果，胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ含量的RSD分別為1.97%、2.20%（n均為6），表明方法重復(fù)性良好。

3.10 加樣回收率試驗(yàn)

稱取已知含量的愈潰貼膜（胡黃連苷Ⅰ含量：8.3μg·g-1、胡黃連苷Ⅱ含量：20μg·g-1）0.1 g，置具塞錐形瓶中，精密稱定，平行稱取9份，分別精密加入80%、100%、120%的胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ?qū)φ掌?，按供試品溶液的制備方法操作，?jì)算加樣回收率。結(jié)果，胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ的平均回收率分別為100.24%、99.61%，RSD分別為1.72%、1.76%，n均為9。

3.11 樣品含量測(cè)定

取3批樣品（批號(hào)：091212、091218、091228），按上述方法測(cè)定胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ的含量，每個(gè)批號(hào)平行測(cè)定3次。結(jié)果，3批樣品中胡黃連苷Ⅰ、胡黃蓮苷Ⅱ的平均總含量分別為每片0.925、0.904、0.903mg。

4 討論

牡丹皮中主要成分是丹皮酚，采用TLC法對(duì)其進(jìn)行鑒別[2]，供試品色譜中，在與丹皮酚對(duì)照品色譜相應(yīng)位置，陰性對(duì)照產(chǎn)生干擾。檢索有關(guān)文獻(xiàn)[3，4]，發(fā)現(xiàn)胡黃連中成分香草酸與丹皮酚分子結(jié)構(gòu)式相似，這可能是導(dǎo)致陰性干擾的原因，因此未建立牡丹皮中丹皮酚的TLC鑒別方法，而改為鑒別牡丹皮中芍藥苷。因供試品雜質(zhì)干擾較大，影響芍藥苷斑點(diǎn)的檢視，故用氧化鋁柱對(duì)供試品進(jìn)行洗脫、精制，以消除背景干擾。

采用TLC法鑒別本品中牡丹皮、青黛、冰片，采用HPLC法測(cè)定胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ的含量，經(jīng)方法學(xué)考察，證明方法靈敏、專屬、快速，可用于愈潰貼膜的質(zhì)量控制。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[S].2010年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄34.

[2]段曉穎，張 輝，高衛(wèi)芳.復(fù)方牛蒡子含片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國(guó)藥房，2009，20（15）：1 158.

[3]鄭啟占，董澤紅，余 靖，等.中藥現(xiàn)代研究與應(yīng)用[M].北京：學(xué)苑出版社，1998：3 232.

[4]國(guó)家中醫(yī)藥管理局中草藥情報(bào)中心站.植物有效成分手冊(cè)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1986：799、1 108.