單曉菊，邸明磊，張巖，馬麗娜，陶遵威（.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市30093；2.天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所，天津市 300020）

苦豆子（Sophora alopecuroides L.）系豆科槐屬多年生草本植物[1]，主要分布在我國西北部干旱荒漠區(qū)。苦豆子全株味苦，性寒，藥用根、莖、全草和種子，具有清熱解毒、祛風(fēng)燥濕、止痛殺蟲等作用[2]。長期以來對苦豆子的研究多圍繞其生物堿成分，對苦豆子多糖的研究較少，而近年來植物多糖的生物活性越來越受到重視。為了開發(fā)苦豆子多糖，課題組對苦豆子多糖進(jìn)行了初步研究，發(fā)現(xiàn)其具有明顯的抗腫瘤作用?？喽棺铀岽汲梁蟮玫降亩嗵菫槌燃t色，影響產(chǎn)品外觀、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和安全。因此，苦豆子多糖脫色工藝顯得尤為重要?；钚蕴渴且环N良好的吸附劑，具有吸附量大、再生速度快、污染小、對液體的流通阻力小等優(yōu)點(diǎn)。有研究表明[3]，活性炭的脫色效果顯著，但對多糖的吸附能力不高。因此，課題組選用活性炭為吸附劑，應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化法，進(jìn)行苦豆子多糖脫色工藝的研究，以期找到適合工業(yè)化生產(chǎn)的苦豆子多糖最佳脫色工藝。

1 儀器與試藥

JJ500電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠）；UV-260紫外分光光度計(jì)（日本Shimadzu公司）；LXJ-ⅡB低速大容量多管離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）；HH-4智能數(shù)顯恒溫水浴鍋（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；真空冷凍干燥機(jī)（美國Labconco公司）。

苦豆子（豆科槐屬，購于內(nèi)蒙古磴口縣金豆商貿(mào)有限公司，經(jīng)天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所天然藥化室吳壽金研究員鑒定為真品）?；钚蕴浚ㄌ旖蚴腥鸾鹛鼗瘜W(xué)品有限公司，批號：20090328）；無水乙醇、95%乙醇、濃硫酸、苯酚等試劑和葡萄糖均為分析純，購自天津市化學(xué)試劑批發(fā)公司。

2 方法

2.1 苦豆子多糖含量測定

采用苯酚-硫酸法[4]。精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖20mg，置500m L量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，配成0.04mg·m L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。精確移取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8m L，置具塞試管中，各加水補(bǔ)充至2.0 m L，然后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的重蒸苯酚1.0m L、濃硫酸6.0 m L，搖勻，室溫放置10m in，于490 nm波長處測定吸光度。以2.0m L水按同樣顯色操作作為空白，以吸光度（x）對葡萄糖質(zhì)量濃度（y）作回歸處理，得回歸方程為y＝1.030 x－0.008（r＝0.999 5）。按下式計(jì)算多糖損失率：多糖損失率＝（脫色前多糖含量－脫色后多糖含量）/脫色前多糖含量×100%。

2.2 苦豆子多糖的提取

取苦豆子干品200 g，以85%乙醇回流脫脂3次，藥渣置于通風(fēng)處晾干，加20倍量水，在100℃沸水中提取3 h，趁熱用布氏漏斗抽濾，減壓濃縮，加4倍體積95%乙醇醇沉，置冰箱過夜，3 000 r·m in-1離心20m in，沉淀用適量無水乙醇洗滌2遍，真空冷凍干燥48 h，得苦豆子粗多糖，sevage法[5]脫蛋白后得苦豆子多糖，備用。

2.3 脫色率的計(jì)算

準(zhǔn)確稱取除蛋白后的苦豆子多糖5 g，加水溶解并定容至500m L，得苦豆子多糖溶液。在可見-紫外光譜700～200 nm波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果溶液無最大吸收波長。根據(jù)多糖溶液脫色前后均為橙黃色，故從溶液的互補(bǔ)色考慮選擇測定波長為450 nm[3]，并按下式計(jì)算脫色率：脫色率＝（脫色前吸光度－脫色后吸光度）/脫色前吸光度×100%。

2.4 單因素試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下的苦豆子多糖溶液若干份，各20m L，依次以活性炭添加量、脫色時(shí)間、脫色溫度為變量，測定苦豆子多糖損失率和脫色率，用以研究以上各變量對苦豆子多糖脫色效果的影響。

2.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用中心組合試驗(yàn)Box-Behnken設(shè)計(jì)方案，以活性炭添加量（W/V，A）、脫色時(shí)間（B）、脫色溫度（C）為考察因素，并以+1、0、-1分別代表變量的水平，用響應(yīng)面法優(yōu)化工藝。因素水平見表1。

表1 因素水平Tab 1 Factorsand levels

3 結(jié)果

3.1 單因素試驗(yàn)

3.1.1 活性炭添加量對脫色效果的影響 分別選取活性炭添加量為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%，于40℃脫色1 h，離心，取上清液，測定脫色率和多糖損失率，結(jié)果分別見圖1、圖2。

由圖1、圖2可知，苦豆子多糖脫色率隨著活性炭添加量的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，添加量＞3%后脫色率明顯下降，原因可能是活性炭添加量過大不利于完全脫炭，反而影響多糖的脫色率；多糖損失率隨活性炭添加量的增加而增加，主要原因是活性炭對多糖有少量的吸附作用。綜上所述，活性炭的添加量應(yīng)選擇3%以下。

3.1.2 脫色時(shí)間對脫色效果的影響 取活性炭添加量為1%，在40 ℃水浴下分別脫色20、30、40、50、60、70、80、90、100m in，離心，取上清液，測定脫色率和多糖損失率，結(jié)果分別見圖3、圖4。

由圖3、圖4可知，苦豆子多糖脫色率在60min達(dá)到最大，以后隨時(shí)間增加緩慢降低；多糖損失率隨時(shí)間增加而增加，60 m in以后增長迅速。綜合考慮，脫色時(shí)間選擇應(yīng)＜60m in。

3.1.3 脫色溫度對脫色效果的影響 取活性炭添加量為1%，分別于20、30、40、50、60 ℃脫色1 h，離心，取上清液，測定脫色率和多糖損失率，結(jié)果分別見圖5、圖6。

由圖5、圖6可知，苦豆子多糖脫色率在50℃達(dá)到最大值，而多糖損失率在30℃以后無明顯變化。綜合考慮，脫色溫度選擇應(yīng)＞30℃。

3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 試驗(yàn)結(jié)果 以脫色率為評價(jià)指標(biāo)優(yōu)選工藝。試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Tab 2 Experimentaldesign and results

3.2.2 模型的建立及其顯著性檢驗(yàn) 利用Design-Expert7.1.6軟件對表2中試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到苦豆子多糖提取率對活性炭添加量（X1）、脫色時(shí)間（X2）、脫色溫度（X3）的二次多項(xiàng)回歸模型：脫色率＝13.775 00+20.250 00X1+1.412 50X2+0.050 000X3－0.215 00X1X2+0.115 00X1X3－7.250 00E－003X2X3－6.850 00X12－7.125 00E－003X22+2.375 00E－003X32。對該回歸模型及其系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表3。

表3 回歸模型及方差分析結(jié)果Tab 3 Decolorization regression model and analysis of variance

由表3可知，回歸模型的P＝0.0002＜0.01，添加量和脫色時(shí)間對脫色率影響極為顯著，脫色溫度對脫色率影響較顯著。本試驗(yàn)得到的二次多項(xiàng)式模型具有高度的顯著性，失擬項(xiàng)在P＝0.05水平上不顯著（P＝0.492 4＞0.05），表明此模型的擬合度很好，能夠準(zhǔn)確預(yù)測和分析苦豆子多糖活性炭脫色工藝結(jié)果。

3.2.3 脫色工藝的響應(yīng)曲面分析與優(yōu)化 根據(jù)表3中結(jié)果繪制各因素間的三維效應(yīng)圖，詳見圖7。

由圖7可看出，活性炭添加量、脫色時(shí)間和脫色溫度之間的相互作用對苦豆子多糖脫色率影響不顯著，活性炭添加量和脫色時(shí)間對苦豆子多糖脫色率的影響很大，隨著活性炭添加量和脫色時(shí)間的增加，苦豆子多糖脫色率也隨著相應(yīng)的增加。經(jīng)優(yōu)化后得到的浸提工藝條件為活性炭添加量0.99%，脫色時(shí)間59.6m in，脫色溫度40.3℃，其脫色率可達(dá)到66.4%。

3.3 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

在最佳脫色條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到的多糖脫色率分別為66.9%、66.7%、66.2%，平均值為66.6%，與預(yù)測值的相對誤差為0.30%；多糖損失率分別為6.42%、5.96%、6.12%，平均值為6.17%。證明響應(yīng)面法優(yōu)化苦豆子多糖脫色工藝是可行的。

4 討論

在響應(yīng)面優(yōu)化的苦豆子多糖活性炭脫色工藝下可得到最佳的脫色效果，且多糖損失率低?；钚蕴繛楹谏?xì)微粉末，無臭、無味，具有無毒、脫色效果好的特點(diǎn)，可以反復(fù)使用，成本低，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

[1]史 偉，陳志國.苦豆子的開發(fā)與利用[J].草業(yè)與畜牧，2007，1：57.

[2]劉勇民.維吾爾藥志（上）[M].烏魯木齊：新疆科技衛(wèi)生出版社，1999：259-299.

[3]和殿峰，李跟區(qū)，陳愛娜.正交試驗(yàn)優(yōu)選魚腥草多糖活性炭脫色工藝[J].中國藥房，2009，20（6）：434.

[4]劉 敏，郭麗梅，張 麗.苯酚-硫酸法測定油松花粉多糖含量研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2010，21（6）：1 526.

[5]張善玉.天然產(chǎn)物多糖脫蛋白方法的研究[J].中國藥房，2009，20（33）：2 633.