張鵬，孟碩，李欣志，劉建勛（中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究中心，北京市100091）

中藥梔子為茜草科植物梔子Gardenia jasminoides的干燥成熟果實(shí)，具有瀉火除煩、清熱利濕、涼血解毒的功效，在中醫(yī)臨床中主要用于治療高血壓、高熱黃疸、小便短赤等證。梔子果實(shí)中主要含有黃酮類、環(huán)烯醚萜類、環(huán)烯醚酮類、有機(jī)酸酯類等化合物，其中環(huán)烯醚萜類成分為國內(nèi)、外公認(rèn)的中藥梔子的主要有效成分[1]。近年研究表明，梔子環(huán)烯醚萜類成分中梔子苷對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠的腦組織有明顯的保護(hù)作用[2]，并且梔子苷在腦缺血狀態(tài)下的血藥濃度和吸收效果優(yōu)于正常狀態(tài)，在體內(nèi)停留的時(shí)間較長，消除較慢[3]。此外，梔子苷能以較高的透過率通過體外模擬的血腦屏障[4]，但梔子環(huán)烯醚萜類中不同成分是否能夠在體通過血腦屏障還需要進(jìn)一步的研究。因此，本研究采用犬iv梔子環(huán)烯醚萜類成分的給藥方式，通過液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）聯(lián)用技術(shù)對(duì)腦脊液的檢測(cè)，分析梔子環(huán)烯醚萜類中透過血腦屏障的成分或代謝物，為中藥梔子治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供物質(zhì)基礎(chǔ)，并有助于將來?xiàng)d子治療腦缺血機(jī)制研究的深入開展。

1 儀器與材料

1.1 儀器

1200型高效液相色譜（HPLC）儀、chemstation工作站（美國Agilent公司）；BV Pulsera型X光機(jī)（荷蘭Philips公司）；API4000Q-TRAP型三重四極桿串聯(lián)MS儀（美國Applied Biosystem公司）；Bruker DRX-500NMR型核磁共振（NMR）儀（德國Bruker公司）；圖譜由北京微量化學(xué)研究所分析中心代測(cè)。

1.2 試藥

梔子苷對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：11079-200410）；梔子苷酸標(biāo)準(zhǔn)品（日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社，批號(hào)：CDR4496）；梔子藥材，購自河北省安國市神農(nóng)中藥飲片有限公司，經(jīng)內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院圖雅教授鑒定為真品；戊巴比妥鈉、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物

健康犬3只，2♂1♀，體重（16.5±1.7）kg，由北京海淀區(qū)學(xué)院路通利實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖廠提供（動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2010-004）。

2 方法與結(jié)果

2.1 梔子環(huán)烯醚萜的制備

梔子藥材加水煎煮提取，通過中等極性大孔吸附樹脂柱，反復(fù)精制，得到梔子環(huán)烯醚萜類成分，相當(dāng)于含生藥20mg·m L-1。

2.2 色譜條件

色譜柱：AgilentEclipse XDB-C18（150mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（15∶85）；流速：1.0m L·m in-1；檢測(cè)波長：238 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10μL。

2.3 腦脊液樣品的預(yù)處理

采集犬腦脊液約300 μL，10 000 r·m in-1離心15m in，取上清液分裝凍存，取10μL上清液進(jìn)樣分析。

2.4 供試品溶液的制備

取“2.3”項(xiàng)下處理的犬腦脊液100μL作為供試品溶液。

2.5 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取梔子苷對(duì)照品10 mg，置于25 m L量瓶中，加30%乙醇至刻度，搖勻，精密量取2m L，置于10m L量瓶中，加30%乙醇至刻度，搖勻，制成每1m L含80μg的溶液，備用。

2.6 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

健康犬（實(shí)驗(yàn)前12 h禁食不禁水），稱重，于前臂橈iv 3%的戊巴比妥鈉30mg·kg-1麻醉，背臥固定于手術(shù)臺(tái)上。清理頭頂皮膚并75%乙醇消毒，在X光機(jī)引導(dǎo)下插入穿刺針至延髓池并固定，穿刺針尾部連接1m L注射器，用于采集腦脊液。同時(shí)分離股靜脈，結(jié)扎遠(yuǎn)心端并插入靜脈插管，用線結(jié)扎牢固，建立靜脈給藥通路。犬腦脊液穿刺X光片見圖1。

圖1 犬腦脊液穿刺X光片F(xiàn)ig 1 X-ray of cerebrospinal fluid obtained in dogs

2.7 給藥和樣品采集

每只犬從股靜脈通路快速推注梔子環(huán)烯醚萜，注射劑量均為10m L·kg-1。注射完畢時(shí)間計(jì)為零，開始記錄用藥后取腦脊液時(shí)間，每間隔30min采集腦脊液100μL，持續(xù)90min，將3個(gè)時(shí)間段內(nèi)收集到的腦脊液混合，按“2.3”項(xiàng)下方法離心取上清液后分裝凍存，備用。每只犬在給藥前采集200μL腦脊液作為空白對(duì)照。

2.8 色譜測(cè)定方法

分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μL，注入色譜儀進(jìn)行測(cè)定。

2.9 犬腦脊液中梔子環(huán)烯醚萜類成分的分析

通過對(duì)照品對(duì)照分析認(rèn)為，在腦脊液中的化學(xué)成分有梔子苷的原形，沒有梔子苷的代謝產(chǎn)物京尼平和梔子苷酸。檢測(cè)到的梔子環(huán)烯醚萜中除梔子苷（c）外，另有2個(gè)色譜峰b、a。通過反復(fù)體外層析分離，再經(jīng)LC-MS檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，色譜b碎片離子峰與體內(nèi)檢測(cè)峰相一致，分子量為550。1H-NMR（D2O）δ：3.74（3H，s，COOCH3）、4.47（1H，d，J＝8Hz）、4.83（1H，d，J＝8 Hz）、5.26（1H，d，J＝7 Hz，H-1）、5.87（1H ，s，H-7）、7.55（1H，s，H-3）；13C-NMR（D2O，DSS為內(nèi)標(biāo)）δ：99.9（C-1）、155.2（C-3）、114.3（C-4）、37.0（C-5）、40.7（C-6）、132.7（C-7）、144.1（C-8）、48.4（C-9）、57.1（C-10）、173.0（C-11）、54.5（OMe）、101.4（C-1′）、75.4（C-2′）、78.6（C-3′）、72.4（C-4′）、78.4（C-5′）、71.3（C-6′）、105.8（C-1″）、75.8（C-2″）、78.4（C-3″）、72.3（C-4″）、78.3（C-5″）、63.5（C-6″），以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[2]報(bào)道一致，鑒定為京尼平-β-D-龍膽雙糖苷（Genipin-1-β-D-gentiobioside）。

同樣，色譜 a LC-MS[M+Na]+m/z：427，分子量為 404。1H-NMR（D2O）δ：4.96（1H，d，J＝9 Hz，H-1）、7.69（1H，d，J＝1 Hz，H-3）、3.11（1H，m，H-5）、6.02（1H，d，J＝2 Hz，H-7）、2.65（1H，t，H-9）、3.74（3H，s，COOCH3）；13C-NMR（D2O）δ ∶100.4（C-1）、154.8（C-3）、106.5（C-4）、69.6（C-l1）、40.1（C-5）、3.8（C-6）、128.5（C-7）、148.9（C-8）、44.1（C-9）、59.8（C-10）、51.6（OMe）、98.7（C-1′）、73.8（C-2′）、72.5（C-3′）、69.2（C-4′）、75.9（C-5′）、60.3（C-6′），以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[5]數(shù)據(jù)一致，鑒定為去乙酰基車葉草苷酸甲酯（Deacetyl-asperulosidic acidmethyl ester）。色譜見圖2。

圖2 高效液相色譜圖A.空白腦脊液；B.含環(huán)烯醚萜類成分腦脊液；a.去乙酰基車葉草苷酸甲酯；b.京尼平-β-D-龍膽雙糖苷；c.梔子苷Fig 2 HPLC chromatograms A.blank cerebrospinal fluid；B.cerebrospinal fluid containing iridoid compounds；a.deacetyl-asperulosidic acidmethyl ester；b.Genipin-1-β-D-gentiobioside；c.geniposide

3 討論

血腦屏障是腦屏障最重要的組成部分，維持著中樞神經(jīng)系統(tǒng)微環(huán)境的穩(wěn)定，但同時(shí)也限制了多數(shù)藥物進(jìn)入腦組織對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療作用。因此，通過血腦屏障是藥物在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮作用的前提條件。反之，將腦脊液中的化學(xué)組分進(jìn)行生物活性的篩選，也是新藥發(fā)現(xiàn)的重要途徑。本研究對(duì)犬采用iv的方式給予梔子環(huán)烯醚萜類成分，在給藥90 m in后腦脊液的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)梔子環(huán)烯醚萜類成分中京尼平-β-D-龍膽雙糖苷、去乙?；嚾~草苷酸甲酯和梔子苷的存在。提示這3種化合物可能是梔子發(fā)揮中樞神經(jīng)系統(tǒng)治療作用的主要活性成分。在目前神經(jīng)藥理研究中，梔子苷可通過提高缺氧缺糖再灌注損傷神經(jīng)細(xì)胞線粒體的活性[6]，減輕腦血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，抑制腦缺血后炎癥因子和黏附分子的表達(dá)[7]，以及對(duì)抗自由基[8]和Ca2+超載[9，10]引起神經(jīng)元損傷等途徑干預(yù)腦缺血損傷級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)的不同環(huán)節(jié)，達(dá)到保護(hù)缺血腦組織的目的。結(jié)合本研究結(jié)果，筆者認(rèn)為梔子苷透過血腦屏障是以上藥理活性的直接原因和首要條件；京尼平-β-D-龍膽雙糖苷和去乙酰基車葉草苷酸甲酯可能也具有一定的中樞神經(jīng)藥理活性，但這些設(shè)想還需要進(jìn)一步分析驗(yàn)證。

在正常生理狀態(tài)下，血腦屏障是由排列緊密的上皮細(xì)胞組成，物質(zhì)交換方式為水溶性小分子直接經(jīng)細(xì)胞間隙擴(kuò)散，脂溶性分子經(jīng)跨膜擴(kuò)散，特異受體介導(dǎo)的胞飲作用，特異載體通道等。雖然本研究結(jié)果證實(shí)，京尼平-β-D-龍膽雙糖苷、去乙?；嚾~草苷酸甲酯和梔子苷能夠通過血腦屏障，但是透過的機(jī)制還需要進(jìn)一步的深入研究。

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