張輝華，羅艷娜，，謝青梅，馬靜云，楊承忠，韓小鳳，，畢英佐

（1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)院，廣東 佛山 528231；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)院 ，廣東 廣州 510642）

防御素是一類古老的內(nèi)源性抗菌多肽，廣泛存在于動物體內(nèi)。自Evans等［1］從雞與火雞異嗜性白細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)β-防御素后，已陸續(xù)從雞、鴨、鴕鳥、鵝和企鵝等禽類動物體內(nèi)分離發(fā)現(xiàn)約30個禽β-防御素基因［2-6］。根據(jù)Lynn等［7］的建議，國際上對禽防御素命名進行了統(tǒng)一規(guī)定，所有禽來源的防御素都命名為AvBDs（Avian beta-defensins）。上傳至NCBI GenBank中登記注冊的鴨β-防御素基因序列有AvBD2、AvBD6、AvBD9、AvBD10。對鴨 AvBD2的生物學(xué)功能研究表明，體外具有抗菌活性與趨化活性［4，8-9］，具有潛在的應(yīng)用價值。因此，本試驗對鴨AvBD2基因進行了克隆、序列分析與比較及在機體各組織器官分布的研究，以期為對其功能及調(diào)控表達奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 載體與受體菌 質(zhì)粒pMD-18T購自寶生物工程（大連）有限公司；受體菌JM109為華南農(nóng)業(yè)大學(xué)家禽基因工程實驗室保存。

1.2 工具酶與主要試劑 質(zhì)粒提取試劑盒和凝膠回收試劑盒為Omega公司產(chǎn)品；Trizol Reagent Kit、AMV、Premix Ex Taq聚合酶為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.3 引物 根據(jù)GenBank上發(fā)表的鴨AvBD2（登錄號：AY641439）及β-actin基因序列和PCR引物的設(shè)計原則，并借助計算機軟件DNAStar進行輔助分析，設(shè)計了4條PCR引物，分別用于進行鴨AvBD2與β-actin基因的擴增。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，序列如下。

Duck2-P1：5′-GAGGGAAGGGACCAAGAAGA-3′；Duck2-P2：5′-GGTTGTAACAGGAAGGAGATT-3′；β-actin-P1：5′-ATGTACCCGGGCATCGCTG-3′；β-actin-P2：5′-TCAGAAGCATTTGCGGTGG-3′

1.4 肝臟總RNA提取 取脾臟組織約0.1g，按Trizol試劑盒說明方法提取總RNA。

1.5 鴨AvBD2基因的RT-PCR擴增 通過二步法進行RT-PCR。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：RNA 1μL，10x RT Buffer 1μL，dNTPs（各10mmol／L）1μL，RNA酶抑制劑0.25μL，Oligo dT-Adapter Primer 0.5 μL，AMV 0.5μL，MgCl22μL，DEPC水補至10 μL?；靹蚝?，30℃反應(yīng)10min，42℃反應(yīng)30min，99℃反應(yīng)5min，5℃冷卻5min。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物直接用于PCR擴增。PCR反應(yīng)體系為：Ex Taq 12.5 μL，引物各0.5μL，模板1μL，雙蒸水補至25μL。PCR程序：94℃預(yù)變性3min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，30個循環(huán)；72℃后延伸10min。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.6 PCR產(chǎn)物的克隆與序列分析 PCR產(chǎn)物經(jīng)過凝膠純化回收后，與載體pMD-18T在下列反應(yīng)體系中4℃過夜連接：Buffer 5μL，pMD-18T1μL，PCR產(chǎn)物4μL。連接產(chǎn)物直接用于轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞。挑取單個的白色菌落，接種于3mL含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)過夜，然后進行菌落PCR與酶切鑒定。酶切鑒定正確的進行測序。所獲得的DNA序列用BLAST程序進行相似性檢索比較。

1.7 鴨AvBD2的組織分布 取1日齡和20日齡“仙湖肉鴨”各3只，放血致死。采皮膚、舌、食道、氣管、心臟、肝臟、肺臟、脾臟、腎臟、腔上囊、胸腺、骨髓、胸肌、腺胃、肌胃、小腸和胰臟組織各1g凍存。提取凍存組織RNA，進行RT-PCR，檢測鴨AvBD2在各個組織器官的分布情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 鴨AvBD2基因的RT-PCR擴增 取鴨肝臟組織，提取總RNA，用鴨AvBD2特異引物，經(jīng)RT-PCR擴增得到一個基因片段，RT-PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳，可以見到1條約350bp大小與預(yù)期長度相吻合目的電泳條帶（圖1）。PCR產(chǎn)物克隆至載體pMD-18T上，圖2為其酶切及菌落PCR結(jié)果。

2.2 鴨AvBD2基因測序結(jié)果及分析 測序結(jié)果見圖3?？寺∑魏塑账嵝蛄虚L為350bp，包含一個長為195bp的ORF框。利用BLAST程序進行核苷酸序列比對，發(fā)現(xiàn)與GenBank中鴨AvBD2的核苷酸序列有98%～100%的相似性，表明所克隆到的片段為鴨AvBD2基因序列。利用信號肽分析軟件對ORF框信號肽序列進行分析（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／SignalP／），得知信號肽裂解位點在22與23位氨基酸之間，即：-GLS-LP-間（見圖3）。以編碼區(qū)序列進行BLAST，發(fā)現(xiàn)同GenBank中已注冊的鴨AvBD2基因相似性為98%與100%。相似性為100%的是中國品種鴨，相似性為98%的是國外品種鴨。差異表現(xiàn)為3個堿基的變化，分別是編碼區(qū)98位堿基由A→T，136位堿基由A→G及150位堿基由C→T；導(dǎo)致有2個氨基酸的變化，即33位氨基酸由K→I，46位氨基酸由I→V。由于氨基酸的變異，導(dǎo)致分子量產(chǎn)生變化及pI值的變異。預(yù)測本研究克隆到的鴨AvBD2分子量大小為7334.93Da，pI值為9.09。Soman等［7］報道的國外品種鴨AvBD2其分子量大小為7305.89Da，pI值為8.81。

圖3 鴨AvBD2基因測序結(jié)果與序列分析

2.3 鴨AvBD2基因的組織器官中分布 對1日齡與20日齡鴨17個組織器官該基因進行檢測，結(jié)果為AvBD2基因在脾臟和腎臟中大量表達；心臟和肝臟中有少量表達；肺臟和骨髓有中等水平表達；在胸腺、腔上囊、小腸、胰腺、腺胃、食管、氣管、舌頭、胸肌、卵巢、皮膚中未見表達。結(jié)果見圖4、圖5。

圖4 AvBD2基因組織器官RT-PCR擴增結(jié)果

圖5 AvBD2基因組織器官RT-PCR擴增結(jié)果

3 討論

通過RT-PCR技術(shù)，本研究克隆獲得長為350 bp的鴨AvBD2基因。目前，在GenBank中公布的鴨AvBD2基因序列有3條，2條是國外品種，1條是國內(nèi)品種。對成熟肽段核苷酸序列進行比對時發(fā)現(xiàn)，2個國外品種鴨的核苷酸序列完全相同，國內(nèi)品種鴨的序列與本研究克隆到的序列也完全相同，但國內(nèi)與國外品種鴨間有3個核苷酸的變化，導(dǎo)致2個氨基酸的變異。這種變化是物種在遺傳選擇過程中的自然選擇所致，還是由于其他外部原因?qū)е碌?，非常值得分析。尤其是這種差異表現(xiàn)在國內(nèi)品種鴨與國外品種鴨之間，環(huán)境或疾病因素是否是導(dǎo)致序列發(fā)生變化的主要因素，這種變化對其生物學(xué)功能是否產(chǎn)生影響，值得研究。另外，這種變化在鴨其他種類β-防御素基因上是否也有，由于對鴨防御素基因研究還比較晚，上傳序列少，沒辦法作出比較。因此還需要有更多的序列及其他種類防御素基因克隆出來以后，才能做出準(zhǔn)確的判斷。不過在對雞AvBD-1基因的研究過程發(fā)現(xiàn)，AvBD-1有兩種形式，即AvBD-1與AvBD-1（α）。它們之間的區(qū)別僅是基因序列上編碼區(qū)3個堿基的不同，導(dǎo)致3個氨基酸的變異，發(fā)生變異的AvBD-1稱為AvBD-1（α）［10］。Harwig等［11］也從雞異嗜性白細(xì)胞中分離純化出這兩種多肽，因此可以排除是等位基因。這兩個基因高度的同源性表明這兩個基因起源于一個關(guān)系非常近的復(fù)制子。這種現(xiàn)象在人α-防御素HNP-1與HNP-3之間也存在，這兩個基因編碼區(qū)核苷酸也只有2個不同，導(dǎo)致2個氨基酸發(fā)生改變，而且在整個基因全長（3.7kb）DNA序列上也只有17個核苷酸的差異，同樣表明，這兩個基因高度的同源性表明這兩個基因起源于一個非常近的復(fù)制子［12］?，F(xiàn)在情況是否與此相似，也有待于研究。

對鴨AvBD2在機體不同組織部位表達分布的研究結(jié)果表明，鴨AvBD2在1日齡與20日齡鴨的脾臟和腎臟組織中均大量表達，在骨髓中呈中等水平表達，在心臟和肝臟中僅少量表達，在其他組織器官中均未檢測到有表達。與Soman等［5］的研究發(fā)現(xiàn)有所不同，他們的結(jié)果是鴨AvBD2在脾臟和骨髓中大量表達，腔上囊、卵巢、小腸也有少量表達?？赡茉蚴桥c鴨品種不同相關(guān)。防御素基因在不同組織中的表達差異性，是與其功能相關(guān)的［13］。如雞 AvBD5、AvBD9和AvBD10在小腸等消化系統(tǒng)組織中有一定量的表達，重組蛋白有抗大腸桿菌、豬致病性鏈球菌、金黃色葡萄球菌和多殺性巴氏桿菌的活性［14-15］。本研究利用RT-PCR技術(shù)成功擴增到鴨AvBD2基因，為進一步對該基因的功能研究奠定基礎(chǔ)。

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