丁 利，陳光達(dá)，許信剛，童德文

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）屬于冠狀病毒科、冠狀病毒屬成員，由其引發(fā)的豬傳染性胃腸炎是豬的一種急性、高度接觸性傳染病，臨床以嘔吐、嚴(yán)重腹瀉、脫水和對(duì)2周齡以內(nèi)仔豬高度致死率為特征。5周齡以上的豬死亡率較低，成年豬幾乎沒有死亡，但感染豬生長緩慢，飼料報(bào)酬率降低。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將TGE定為B類傳染病，是我國法定重點(diǎn)防控的疫病之一。本病在許多國家和地區(qū)廣泛流行，經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，近年來該病在我國的流行呈明顯上升趨勢(shì)，同時(shí)亦有病毒的分離報(bào)道［1-5］。本試驗(yàn)從陜西省某豬場(chǎng)發(fā)病豬只的腹瀉糞便等樣品中分離到1株豬傳染性胃腸炎病毒，命名為TGEV shaanxi株，并對(duì)其進(jìn)行了系統(tǒng)鑒定。

1 材料與方法

1.1 病料和細(xì)胞 空腸內(nèi)容物及腹瀉糞便采集于陜西省某疑似感染TGE的豬場(chǎng)，于滅菌生理鹽水中凍存，低溫運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室備用；PK-15細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑 DMEM為Gibco公司產(chǎn)品；胰酶、瓊脂糖、RNase A為Sigma公司產(chǎn)品；新生牛血清為 Hyclone公司產(chǎn)品；Taq DNA聚合酶、DL-～DNA Marker、pMD18-T vector，購自大連TaKaRa公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，購自Promega公司；病毒基因組RNA提取試劑盒，購自BioTeke公司；高純度質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA凝膠回收純化試劑盒，購自威格拉斯生物技術(shù)有限公司；豬傳染性胃腸炎病毒弱毒疫苗，購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所；受體菌DH5α、豬傳染性胃腸炎病毒陽性血清由中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病中心惠贈(zèng)。

1.3 方法

1.3.1 病料的處理 解凍TGE病豬的空腸內(nèi)容物以及腹瀉糞樣，反復(fù)凍融3次后，6000r／min離心5min，收集上清液，上清液經(jīng)0.22μm孔徑細(xì)菌濾器除菌后，置-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 病毒分離培養(yǎng) 將過濾后的病料上清液1mL接種于單層PK-15細(xì)胞，37℃吸附1h，棄上清后加入含2%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5d，觀察細(xì)胞病變（CPE）。將培養(yǎng)細(xì)胞反復(fù)凍融3次，取凍融液1mL盲傳3～6代進(jìn)行病毒分離和細(xì)胞適應(yīng)，傳至出現(xiàn)較穩(wěn)定的CPE后收毒，盲傳6代未出現(xiàn)CPE則判為陰性。

1.3.3 病毒TCID50的測(cè)定 按照參考文獻(xiàn)［6］方法進(jìn)行。

1.3.4 核酸類型鑒定及氯仿試驗(yàn) 按照參考文獻(xiàn)［3］方法進(jìn)行。

1.3.5 病毒中和試驗(yàn) 將TGEV陽性血清進(jìn)行系列稀釋（1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1280），加到96孔反應(yīng)板中，25μL／孔；將病毒稀釋到200TCID50，加入到上述各反應(yīng)孔中，25μL／孔，37℃作用1h；按常規(guī)方法制成細(xì)胞懸液，50μL／孔加到上述各孔中，37℃培養(yǎng)，逐日觀察并記錄CPE。同時(shí)設(shè)立正常細(xì)胞對(duì)照、不加血清的病毒液對(duì)照、陰性血清對(duì)照。

1.3.6 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中公布的TGEV基因序列，利用計(jì)算機(jī)輔助軟件Premier 5.0設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，上游引物為P1：5′-ATGGCCAACCAGGGACAAC-3′；下游引物為P2：5′-TGGAGGAAGACGAGCATC-3′），用于擴(kuò)增1149bp的N基因

1.3.7 病毒RNA 提取和RT-PCR 參照病毒基因組RNA 提取試劑盒說明書從細(xì)胞毒中提取總RNA。RT體系：RNA模板2μL、dNTPs 2μL、P22μL，70℃作用5min然后，向體系中加入5×RT Buffer 5μL、RNase inhibitor 0.2μL、M-MLV 0.5 μL、DEPC水9.3μL。37℃孵育60min，95℃10 min，4℃10min。PCR體系：10×PCR Buffer 2.5 μL、dNTPs 2μL、上下游引物（20pmol／μL）各0.5 μL、cDNA 2μL、Taq DNA polymerase 0.2μL、滅菌雙蒸水16.3μL。PCR程序?yàn)椋?4℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃45s，35個(gè)循環(huán)；72℃10min?；厥誔CR產(chǎn)物，將N基因純化后插入到T載體中，將重組質(zhì)粒送交南京金斯瑞生物科技公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.3.8 序列分析 應(yīng)用DNAStar軟件對(duì)TGEV shaanxi分離株N基因的測(cè)序結(jié)果與GenBank中已發(fā)表的10株TGEV毒株的N基因序列進(jìn)行核苷酸及氨基酸序列比較分析并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離培養(yǎng) 初代病毒液接種PK-15細(xì)胞60h時(shí)CPE不典型，盲傳至第3代時(shí)細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、聚堆等現(xiàn)象。傳至第5代時(shí)細(xì)胞病變達(dá)80%，時(shí)間穩(wěn)定在48h～60h，細(xì)胞折光性增強(qiáng)，聚集、變圓，形成空斑，逐漸成拉網(wǎng)狀病變，最后成片脫落（圖1）。

圖1 正常PK-15細(xì)胞與接毒后60h的PK-15細(xì)胞 （100×）

2.2 病毒TCID50及中和試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果 根據(jù)TCID50測(cè)定數(shù)據(jù)（表1）可知，使半數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)CPE的病毒稀釋度（即TCID50）介于1×10-6～1×10-7之間，按Reed-Muench法得出 TCID50為10-6.68／0.1mL。

利用固定病毒稀釋血清法得出，能保護(hù)50%細(xì)胞的血清稀釋度介于1∶320～1∶640之間。根據(jù)Reed-Muech氏法計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)陽性血清的中和效價(jià)為1∶431。而分離毒株與陰性血清作用后CPE沒有被抑制，陽性血清對(duì)細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及空白試驗(yàn)細(xì)胞正常。

2.3 病毒理化試驗(yàn)

2.3.1 病毒核酸類型鑒定 采用BUDR法進(jìn)行病毒核酸類型鑒別，結(jié)果對(duì)照組TCID50為10-6.68／0.1 mL，試 驗(yàn) 組 TCID50為 10-6.52／0.1mL，二 者 的TCID50的對(duì)數(shù)差值小于1，證明病毒的核酸類型為RNA。

2.3.2 氯仿敏感試驗(yàn) 經(jīng)氯仿處理的病毒液接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，結(jié)果對(duì)照組TCID50為10-6.68／0.1mL，試驗(yàn)組 TCID50為10-3.84／0.1mL，二者的TCID50的對(duì)數(shù)差值為2.84，說明該病毒對(duì)氯仿敏感。

表1 感染TGEV病毒后CPE的出現(xiàn)情況

2.4 分離病毒的RT-PCR鑒定結(jié)果 從分離病毒的小腸內(nèi)容物、病毒細(xì)胞培養(yǎng)液和TGEV疫苗毒中均擴(kuò)增出了約～bp的片段（圖2），與預(yù)期大小一致。說明該病毒株為TGEV，命名為TGEV shaanxi株。

2.5 序列分析及進(jìn)化樹 將所測(cè)的N基因序列與GenBank中已發(fā)表的10株TGEV毒株的N基因序列進(jìn)行同源性比較分析。結(jié)果表明，TGEV shaanxi株與其他分離的TGEV株之間的同源性很高，核苷酸同源性為94.3%～98.3%，氨基酸同源性為95.6%～99.4%。系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹（圖3）分析表明，TGEV shaanxi株與HN2002株親緣關(guān)系較近，處于同一分支。

圖2 病毒RT-PCR鑒定

3 討論

圖3 TGEV shaanxi分離株與TGEV參考毒株N基因系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹分析

TGEV可在多種細(xì)胞系如豬睪丸細(xì)胞（ST細(xì)胞）、豬腎細(xì)胞（PK-15細(xì)胞、IBRS-2細(xì)胞）、豬甲狀腺細(xì)胞等多種細(xì)胞上生長。本試驗(yàn)選用了PK-15細(xì)胞進(jìn)行病毒分離，病毒很快適應(yīng)PK-15細(xì)胞，產(chǎn)生典型的細(xì)胞病變：細(xì)胞皺縮、聚集、拉網(wǎng)、脫落，胞漿內(nèi)形成空泡等。隨著病毒作用時(shí)間的延長，細(xì)胞幾乎全部脫落。TGEV有4種結(jié)構(gòu)蛋白，分別為纖突糖蛋白（S蛋白）、膜內(nèi)在蛋白（M蛋白）、核衣殼蛋白（N蛋白）和小膜蛋白（sM蛋白）［7］。其中核衣殼蛋白基因（N）是TGEV主要結(jié)構(gòu)蛋白基因，可與基因組RNA組裝成核糖核蛋白復(fù)合物摻入病毒粒子中［8-9］。N蛋白不僅在病毒致病性、轉(zhuǎn)錄和翻譯及增強(qiáng)細(xì)胞免疫等方面起到重要作用，而且具有輔助增強(qiáng)病毒RNA復(fù)制的能力。比較分離株N基因與GenBank中其他TGEV N基因序列，發(fā)現(xiàn)N基因高度保守，核苷酸同源性為94.3%～98.3%，氨基酸同源性為95.6%～99.4%，表明陜西分離株與其他分離的TGEV株之間的同源性很高。系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹分析表明，TGEV shaanxi株與HN2002株親緣關(guān)系較近，處于同一分支，表明我國不同地區(qū)分離毒株的N基因差異不大。

本試驗(yàn)通過病毒分離、細(xì)胞培養(yǎng)、核型鑒定、氯仿敏感性試驗(yàn)、RT-PCR鑒定、序列分析等從陜西省發(fā)生腹瀉的仔豬小腸內(nèi)容物及腹瀉糞便中分離到1株豬傳染性胃腸炎病毒，命名為TGEV shaanxi株。測(cè)定的病毒TCID50顯示該毒株在體外培養(yǎng)增殖性能穩(wěn)定，病毒滴度高。豬傳染性胃腸炎病毒shaanxi株的成功分離對(duì)陜西地區(qū)該病的病原學(xué)研究、流行病學(xué)調(diào)查、診斷和防制具有重要意義，也為今后開展TGEV流行病學(xué)、分子病毒學(xué)、疫苗免疫及診斷研究提供有價(jià)值的毒株。

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