單曉楓，郭偉生，吳同壘，王偉利，錢愛東

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130118；2.吉林進出口檢驗檢疫局，吉林 長春 130062）

維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii，AV）屬于弧菌科、氣單胞菌屬，其廣泛分布于水體和陸地，可導(dǎo)致人食物中毒，引發(fā)胃腸炎、腹膜炎、敗血癥、腦膜炎等疾?。?-2］；此外，該菌還可引起各種水產(chǎn)動物的不同疾病的暴發(fā)，如框鏡鯉敗血癥、青蝦軟殼綜合征、魚的流行性潰瘍綜合征等等［3-5］。維氏氣單胞菌可產(chǎn)生一系列的毒力因子，如氣溶素、溶血素、胞外蛋白酶、內(nèi)毒素、粘附素等。其中溶血素（hemolysin，hly）是基因組DNA編碼的毒力因子，其聚合后插到細胞膜上，形成通道，導(dǎo)致溶血。但有關(guān)維氏氣單胞菌溶血素的研究并不充分，有許多研究甚至將氣溶素與溶血素混為一談，目前，GenBank上尚未見維氏氣單胞菌溶血素的全基因序列。鑒于此，本試驗依據(jù)不同氣單胞菌屬菌種的溶血素基因，設(shè)計1對特異性引物，克隆了維氏氣單胞菌的溶血素基因片段，并對其編碼蛋白進行相關(guān)分析，以期為研究維氏氣單胞菌溶血素在致病、毒力誘導(dǎo)免疫保護，以及建立特異性免疫學(xué)檢測方法等方面建立基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種 維氏氣單胞菌CY0806，分離于吉林省某漁場框鏡鯉，經(jīng)生理生化、16SrRNA序列分析，鑒定為維氏氣單胞菌，由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究室保存；基因工程菌E.coli DH5α，由本實驗室保存制備；pMD18-T載體，購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 主要試劑 DL-～Marker、Taq DNA聚合酶、dNTP，均購自寶生物工程（大連）有限公司；DNA凝膠回收試劑盒，購自愛思進生物技術(shù)有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒，購自北京索萊寶科技有限公司；氣單胞菌培養(yǎng)基RS，購自北京陸橋技術(shù)有限責任公司；其他試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

1.3 溶血活性檢測 將維氏氣單胞菌CY0806劃線接種于1%兔血平板，30℃培養(yǎng)24h，觀察其溶血活性。

1.4 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank報道的氣單胞菌屬不同菌種的溶血素基因，用生物軟件Primer Premer 5.0設(shè)計一對特異性引物，上游引物P1：5′-GCGGAATTCATGCAAAAACTAAAAA-3′，下游引物 P2：5′-ATCAAGCTTTTAAAACTGGCTCTCGGC-3′。引物由寶生物工程（大連）有限公司。

1.5 維氏氣單胞菌hly基因片段的PCR擴增 以維氏氣單胞菌CY0806株基因組DNA為模板，P1、P2為引物，采用50μL反應(yīng)體系進行PCR。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2min；94℃變性40s，48℃復(fù)性40s，72℃延伸80s，共34循環(huán)；72℃10min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切取目的條帶用凝膠回收試劑盒純化回收。

1.6 目的基因的克隆與鑒定 將回收產(chǎn)物與pMD18-T載體連接后，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞中，在含氨芐青霉素培養(yǎng)基平板上37℃培養(yǎng)12～16 h，挑取單個菌落，增菌，提取質(zhì)粒，以此為模板進行PCR鑒定。將陽性重組質(zhì)粒送至寶生物工程（大連）有限公司測序。

1.7 序列分析與結(jié)構(gòu)預(yù)測 利用相關(guān)生物信息學(xué)軟件或網(wǎng)站，將克隆基因片段的同源性、遺傳演化關(guān)系、編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)、B細胞康威進行分析和預(yù)測。

2 結(jié)果

2.1 溶血性分析 菌株CY0806在血平板上出現(xiàn)明顯的溶血圈，為β-溶血。

2.2 目的基因的PCR擴增與鑒定 用P1、P2引物對維氏氣單胞菌CY0806溶血素基因片段進行擴增，獲得一條與目的片段大小相符的條帶（圖1）；以陽性重組質(zhì)粒為模板，通過PCR得到約400bp的片段，表明溶血素基因已成功克隆于載體中。

圖1 維氏氣單胞菌hly基因的PCR擴增

2.3 目的基因的序列分析及系統(tǒng)進化樹構(gòu)建 經(jīng)序列測定，擴增出的基因片段長432bp，編碼137個氨基酸，相對分子量15768.75u，含有17個強堿性氨基酸（K、R）、13個強酸性氨基酸（D、E）、45個疏水氨基酸（A、I、L、F、W、V）、40個極性氨基酸（N、C、Q、S、T、Y）。

在NCBI上檢索并下載不同菌種的溶血素基因，用Mega4.0軟件與菌株CY0806溶血素基因片段構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖2）。分析顯示，菌株CY0806溶血素基因片段與氣單胞菌屬菌種處于同一分支，同源性在95%以上。

2.4 目的基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 以Garmier-Robson方法預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，α螺旋占38.4%，β折疊占5.07%，β轉(zhuǎn)角占28.3%，無規(guī)則蜷曲占29.7%；而通過Chou-Fosman分析：α螺旋占26.1%，β折疊占21.7%，β轉(zhuǎn)角占40.6%（圖3）。

2.5 B細胞表位預(yù)測 以Kyte-Doolittle的氨基酸親水預(yù)測結(jié)果、Emini的蛋白表面可及性預(yù)測結(jié)果、Chou-Fasman方案的β轉(zhuǎn)角分析結(jié)果、Karplus-Sohulz的原則預(yù)測柔性蛋白結(jié)果，綜合分析預(yù)測，得到以下四個區(qū)域：5～10、48～52、99～104、126～130可能形成B細胞表位。

3 討論

維氏氣單胞菌是近年來新型的人-獸-魚共患病原菌，其可感染人并引發(fā)多種疾??；此外，也可危害大部分淡水魚類、蝦、蟹等水生動物。而溶血素是氣單胞菌的主要致病因子之一，其毒力作用與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，研究表明，溶血素具有水溶性跨膜毒素的特征--溶血素N端可與三段β折疊的溶血素結(jié)構(gòu)組成一個“門閂”結(jié)構(gòu)［6-7］。本試驗克隆的溶血素基因雖然只是一個片段，但二級結(jié)構(gòu)分析表明，此片段存在β折疊，至于是否能形成“門閂”結(jié)構(gòu)，還需用其他方法擴增出溶血素全長序列，推導(dǎo)出三級結(jié)構(gòu)驗證。

本試驗克隆到框鏡鯉維氏氣單胞菌分離株CY0806的溶血素基因片段，其序列與氣單胞菌屬不同菌種有著較高的同源性（95%以上），但與大腸桿菌、弧菌等溶血素同源性較低，說明氣單胞菌屬內(nèi)各菌種的溶血素基因可能有著相同起源，為尋找氣單胞菌共同抗原提供幫助。

蛋白質(zhì)的親水性、柔韌性、β轉(zhuǎn)角、表面可及性等在抗原的形成方面發(fā)揮著重要作用，本試驗綜合了不同參數(shù)，預(yù)測該溶血素片段有4個氨基酸區(qū)域指標達到抗原區(qū)標準，說明溶血素具有很好的抗原性。

本試驗成功的克隆了維氏氣單胞菌CY0806株的溶血素基因片段，并對其同源性、編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)、B細胞表位進行預(yù)測分析，結(jié)果為維氏氣單胞菌溶血素全長基因的擴增、其作為基因工程疫苗的候選抗原，以及維氏氣單胞菌特異性免疫學(xué)檢測方法的建立奠定了基礎(chǔ)。

［1］Chim H，Song C.Aeromonas infection in critically ill burn patients［J］.BURNS，2007，33：756-759.

［2］Wang J T，F(xiàn)ang C T，Hsueh P R，et al.Spontaneous bacterial empyema caused by Aeromonas veronii biotype sobria［J］.Diagnostic Microbiology and Infectious Disease，2000，37：271-273.

［3］龔倩，高淑琴，單曉楓，等.框鏡鯉致病性維氏氣單胞菌的分離鑒定［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)學(xué)報，2010，32（12）：981-983.

［4］潘曉藝，沈錦玉，李建應(yīng)，等.青蝦“軟殼綜合征”病原及其特性［J］.微生物學(xué)通報，2009，36（10）：1571-1576.

［5］Rahman M，Colque-Navarro P，Khn I，et al.Identification and characterization of pathogenic Aeromonas veronii biovar sobria associated with epizootic ulcerative syndrome in fish in Bangladesh［J］.Applied Environmental Microbiology，2002，68（2）：650-655.

［6］Han J H，Lee J H，Choi Y H，et al.Purification，characterization and molecular cloning of V ibrio f luvialis hemolysin［J］.J Biochim Biophys Acta，2002，1559（1／2）：106-114.

［7］Miles G，Jayasinghe L，Bayley H.Assembly of the Bi-component leukocidin pore examined by truncation mutagenesis［J］.J Biol Chem，2006，281（4）：2205-2214.