查艷，趙盈葶，楊霞，陳運(yùn)芬，俞雷（.貴州省人民醫(yī)院腎內(nèi)科，貴陽市550004；2.貴州省電力醫(yī)院，貴陽市 550004）

氯沙坦（Losartan）是血管緊張素Ⅱ受體1型拮抗藥，具有降壓和減少尿蛋白的療效[1]；但其抑制腎小管-間質(zhì)炎癥反應(yīng)，從而保護(hù)腎功能的具體機(jī)制目前尚不完全清楚。巨噬細(xì)胞（巨噬細(xì)胞標(biāo)記抗原ED-1+的細(xì)胞）作為腎組織的主要炎癥浸潤細(xì)胞存在于許多原發(fā)和繼發(fā)性腎臟疾病中，巨噬細(xì)胞移動抑制因子（Macrophage migration inhibitory factor，MIF）與腎臟組織學(xué)損害、蛋白尿程度及腎功能衰退密切相關(guān)[2，3]。因此，筆者在進(jìn)展性腎炎（Progressive nephritis）大鼠模型[4]中，觀察腎小管-間質(zhì)細(xì)胞MIF的表達(dá)與間質(zhì)炎癥的相關(guān)性，以及給予不同劑量氯沙坦干預(yù)后MIF在腎小管-間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)的變化，探討氯沙坦是否可以通過調(diào)節(jié)MIF的表達(dá)來改善腎小管-間質(zhì)的炎癥反應(yīng)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

全自動多功能生化分析儀（日本Hitachi公司）；SN-628放射免疫γ計(jì)數(shù)儀（中國科學(xué)院上海原子核研究所）；光學(xué)顯微鏡、C3040-ADU顯微圖像分析系統(tǒng)（日本Olympus公司）；LE5001鼠尾無創(chuàng)血壓測量儀（美國普升科技有限公司）。

1.2 試藥

氯沙坦片（杭州默沙東制藥公司，批號：100576，規(guī)格：每片50 mg）；小鼠抗大鼠MIF抗體、小鼠抗大鼠ED-1單克隆抗體、鼠單克隆IgG（OX-7）抗Thy1.1抗體（IgG（OX-7）mouse monoclonal anti-Thy1.1 antibody）、正常山羊血清（美國Santa Cruz Biotechnology公司）；LSAB免疫組織化學(xué)（組化）試劑盒（丹麥Dako公司）。

1.3 動物

Wistar大鼠，♂，體重（126.7±10）g，由重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司提供，二級，合格證號：SCXK（渝）2007-0005。

2 方法

2.1 建模與給藥[5]

取大鼠行右腎切除并注射鼠單克隆IgG（OX-7）抗Thy1.1抗體2次建立進(jìn)展性腎炎大鼠模型，于第4周時(shí)取部分大鼠立即處死作為模型組，將剩余模型大鼠分為對照組和氯沙坦高、低劑量組（80、20 mg·kg－1·d－1），再另取大鼠行假手術(shù)作為假手術(shù)組，每組5只，連續(xù)給藥4周。實(shí)驗(yàn)第8周時(shí)在麻醉狀態(tài)下處死剩余所有大鼠，取左腎標(biāo)本，于－70℃冰箱保存。

2.2 觀察指標(biāo)

2.2.1 MIF、ED-1的免疫組化染色。取10%中性甲醛固定的3μm厚石蠟?zāi)I組織切片，常規(guī)脫蠟、水化；浸入3%H2O210 min除去內(nèi)源性過氧化物酶，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3次，每次3～5 min；微波修復(fù)抗原，PBS洗3次，每次3～5 min；正常山羊血清封閉10 min，PBS洗3次，每次3～5 min；滴加稀釋的一抗鼠單克隆IgG（OX-7）抗Thy1.1抗體（1∶100，V/V），4 ℃過夜，PBS洗3次，每次3～5 min；分別滴加小鼠抗大鼠MIF抗體及小鼠抗大鼠ED-1單克隆抗體（1∶50），室溫孵育30 min；二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木素輕度復(fù)染，以PBS洗3次，每次3～5 min，脫水，透明，封片。檢測采用顯微圖像分析系統(tǒng)對各組染色結(jié)果進(jìn)行積分光密度（IOD）測定，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野（400倍），每個(gè)視野代表0.13 mm2的區(qū)域面積，計(jì)算其IOD，取平均值作為MIF、ED-1的表達(dá)情況。

2.2.2 MIF和ED-1在同一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)檢測。采用微波免疫組化雙重染色檢測，取對照組腎組織切片，第1重染色同“2.2.1”項(xiàng)下“常規(guī)脫蠟……4℃過夜，PBS洗3次，每次3～5 min”操作，再滴加小鼠抗大鼠MIF抗體（1∶100稀釋），DAB顯色，陽性物呈棕色。完成第1重染色后將切片浸人0.01 mmol·L－1、pH6.0的枸櫞酸緩沖液中置微波爐加熱（800 W）10 min，自然冷卻至室溫后用PBS洗滌，接著用巨核細(xì)胞酶標(biāo)染色（APAAP）法行第2重染色，滴加小鼠抗大鼠ED-1單克隆抗體（1∶500稀釋），再孵育、顯色、沖洗后觀察陽性物呈紫藍(lán)色。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 11.3統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組均數(shù)的比較采用單因素方差分析。相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 MIF、ED-1的免疫組化檢測結(jié)果

3.1.1 MIF的表達(dá)。結(jié)果表明，假手術(shù)組MIF幾乎無表達(dá)，與其比較，模型組和對照組MIF表達(dá)顯著升高（P＜0.001），主要集中在腎小管-間質(zhì)細(xì)胞的胞漿。與模型組和對照組比較，氯沙坦高、低劑量組MIF表達(dá)明顯降低（P＜0.01或P＜0.001）。具體指標(biāo)詳見表1。切片圖見圖1。

表1 各組大鼠MIF、ED-1表達(dá)比較（±s，n＝5）Tab 1 Comparison of MIF and ED-1 in each group（±s，n＝5）

表1 各組大鼠MIF、ED-1表達(dá)比較（±s，n＝5）Tab 1 Comparison of MIF and ED-1 in each group（±s，n＝5）

與假手術(shù)組比較：＊P＜0.001；與模型組比較：#P＜0.01，##P＜0.001；與對照組比較：ΔP＜0.01，ΔΔP＜0.001vs.sham operation group：＊P＜0.001；vs.model group：#P＜0.01，##P＜0.001；vs.control group：ΔP＜0.01，ΔΔP＜0.001

指標(biāo)MIF/×103 ED-1/×103假手術(shù)組1.81±0.24 1.64±0.13模型組54.28±5.64＊27.96±4.15＊對照組58.79±6.02＊31.47±4.09＊氯沙坦低劑量組24.05±3.18#Δ 4.16±0.52##ΔΔ氯沙坦高劑量組22.64±3.46#Δ 2.32±0.19##ΔΔ

圖1 各組大鼠腎組織MIF和ED-1表達(dá)的切片圖（×200）Fig 1 Slice map of MIF and ED-1 expression of kinedy tissue in each grou（p×200）

3.1.2 ED-1的表達(dá)。結(jié)果表明，假手術(shù)組ED-1幾乎無表達(dá)，與其比較，模型組和對照組ED-1表達(dá)顯著升高（P＜0.001），主要集中在腎小管-間質(zhì)細(xì)胞的胞漿。與模型組和對照組比較，氯沙坦高、低劑量組ED-1表達(dá)明顯降低（P＜0.01或P＜0.001）。具體指標(biāo)詳見表1。切片圖見圖1。

3.2 MIF和ED-1在同一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)檢測結(jié)果

MIF（棕色）和ED-1（藍(lán)紫色）同時(shí)顯色在腎小管-間質(zhì)細(xì)胞的胞漿見圖2。

4 討論

MIF蛋白含114個(gè)氨基酸，由α鏈和β鏈組成三維晶體結(jié)構(gòu)，其不僅主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，而且可作用于巨噬細(xì)胞，引起巨噬細(xì)胞在局部浸潤、增生以及刺激巨噬細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子[6]。MIF的主要生物效應(yīng)是抑制巨噬細(xì)胞的游走，促進(jìn)巨噬細(xì)胞在炎癥局部的聚集、增生、活化及分泌一些細(xì)胞因子如（白介素（IL）-1、腫瘤壞死因子（TNF）-α），增強(qiáng)炎癥反應(yīng)程度。有研究[7]發(fā)現(xiàn)在給大白兔注射腎毒血清的同時(shí)腹腔注射抗MIF中和抗體，能有效防止腎組織損害的發(fā)生、發(fā)展。但MIF在進(jìn)展性腎炎中的作用及是否能夠通過阻斷MIF的表達(dá)而減輕腎小管間質(zhì)進(jìn)行性損害尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

圖2 MIF和ED-1表達(dá)在腎小管-間質(zhì)同一個(gè)細(xì)胞的切片圖（×400）Fig 2 Slice map of MIF and ED-1 expression in same tubulointerstitial cell（×400）

本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)MIF、ED-1在假手術(shù)組的腎小管-間質(zhì)細(xì)胞中幾乎不表達(dá)，在模型組和對照組的腎小管-間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)明顯升高（P＜0.001）。為了檢測MIF是否能抑制ED-1向其他組織擴(kuò)散，本實(shí)驗(yàn)采用雙重免疫組化染色檢測了MIF與ED-1是否在同一個(gè)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，結(jié)果表明MIF和ED-1同時(shí)顯色于同一個(gè)細(xì)胞的胞漿。這與既往的報(bào)道[6]相一致。經(jīng)過不同劑量氯沙坦治療4周后，進(jìn)展性腎炎模型大鼠腎小管-間質(zhì)炎癥反應(yīng)明顯改善，MIF和ED-1表達(dá)明顯降低（P＜0.01或P＜0.001）。有研究[8]提示，MIF可以刺激巨噬細(xì)胞增生、活化及分泌TNF-α等細(xì)胞因子；反過來，TNF-α也可以刺激MIF表達(dá)的上調(diào)，引起組織學(xué)損害。氯沙坦可能通過下調(diào)TNF-α的表達(dá)，從而抑制了MIF和ED-1在進(jìn)展性腎炎模型大鼠腎小管-間質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)和聚集。其具體的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步的探討。

腎小管-間質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)也是進(jìn)展性腎炎的一個(gè)主要表現(xiàn)，是預(yù)測腎功能下降的重要標(biāo)志。通過應(yīng)用氯沙坦抑制腎小管-間質(zhì)細(xì)胞中MIF的表達(dá)，可能是早期控制炎癥反應(yīng)，進(jìn)而防治腎間質(zhì)纖維化的重要途徑之一。

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