李明月，楊驚宇，劉西京，倪建新，蔡昌龍(.廣東東莞市塘廈醫(yī)院，東莞市57；.廣東深圳市寶安區(qū)中醫(yī)院，深圳市58；.廣東深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院，深圳市58)

藥對是中藥配伍中的最小單位，為歷代醫(yī)藥學(xué)家所重視。黃連-吳茱萸藥對的應(yīng)用歷史悠久，臨床根據(jù)不同情況，經(jīng)常變換黃連-吳茱萸的配伍比例，達到辯證論治的目的，有左金丸(6∶1)、變通丸(又叫茱萸丸，1∶1)和反左金丸(1∶6)等，均通過改變該藥對配伍比例而來，常用于脾胃功能失調(diào)有關(guān)的疾病[1，2]。其中，變通丸原方早在北宋《太平圣惠方·治水泄諸方》中就有記載，由黃連和吳茱萸按1∶1組成，主治虛寒型下痢水瀉。目前研究表明，黃連中有效成分為小檗堿型生物堿，具有抗病原微生物等作用[3]。筆者在參照文獻[4～8]的基礎(chǔ)上，建立了以反相高效液相色譜(RP-HPLC)法測定變通丸中鹽酸小檗堿含量的方法。

1 儀器與試藥

2695-2998 HPLC儀，包括Waters色譜工作站、紫外檢測器(美國Waters公司)；CPA225D電子天平(德國Sartorius公司)。

鹽酸小檗堿對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:110713-200910)；變通丸(深圳市寶安區(qū)中醫(yī)院自制，批號:20101111、20101201、20101224)；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:SunFireTMC18(250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm)；流動相:1.5 mmol·L-1十二烷基硫酸鈉溶液(A，以磷酸調(diào)pH 5.0)-乙腈(B)，梯度洗脫(0 min，A∶B＝65∶35；10 min，A∶B＝50∶50；20 min，A∶B＝25∶75)；檢測波長:265 nm；流速:0.8 mL·min-1；柱溫:25℃；進樣量:10 μL。

2.2 供試品溶液的制備

取變通丸粉末約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入鹽酸-甲醇(1∶100)50 mL，稱定重量，冷浸1 h后加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用鹽酸-甲醇(1∶100)補足減失的重量，搖勻，以微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 對照品溶液的制備

精密稱取鹽酸小檗堿對照品15.20 mg，置于50 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成含鹽酸小檗堿304 μg·mL-1的對照品貯備液。再精密量取此貯備液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得鹽酸小檗堿系列對照品溶液。

2.4 陰性對照溶液的制備

取吳茱萸藥材，按制劑工藝制備陰性樣品，按“2.2”項下方法制成缺黃連的陰性對照溶液。

2.5 系統(tǒng)適用性試驗

在“2.1”項下色譜條件下，分別精密吸取對照品貯備液、供試品溶液、缺黃連的陰性對照溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果，鹽酸小檗堿峰的保留時間約為15 min，陰性對照色譜在此處無假陽性峰，表明其他組分對測定無干擾；鹽酸小檗堿峰與相鄰峰的分離度＞1.5。理論板數(shù)按鹽酸小檗堿峰計算應(yīng)≥4000。色譜見圖1。

2.6 線性關(guān)系考察

在“2.1”項下色譜條件下，精密吸取上述系列對照品溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀中，測定峰面積。以峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(X，μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，進行線性回歸，得回歸方程為Y＝1E+06X+56513(r＝0.9998)。結(jié)果表明，鹽酸小檗堿的質(zhì)量濃度在60.8～304.0 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.7 精密度試驗

在“2.1”項下色譜條件下，精密吸取對照品溶液(121.6 μg·mL-1)10 μL，連續(xù)進樣6次，測定。結(jié)果，鹽酸小檗堿峰面積的RSD＝0.85%(n＝6)，表明儀器精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗

取同一批樣品適量，共6份，分別按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件各進樣1次，測定。結(jié)果，鹽酸小檗堿含量的RSD＝1.25%(n＝6)，表明此方法重復(fù)性良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗

在“2.1”項下色譜條件下，對同一供試品溶液于制備后0、4、8、12、24 h進樣，每次10 μL，測定。結(jié)果，鹽酸小檗堿峰面積的RSD＝1.04%(n＝5)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.10 加樣回收率試驗

取已知含量的樣品粉末0.1 g，精密稱定，共6份，分別置50 mL容量瓶中，分別精密加入鹽酸小檗堿對照品溶液適量，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，依法測定，結(jié)果見表1。

2.11 樣品含量測定

取變通丸3批，分別按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行含量測定，計算。結(jié)果，3批樣品(批號:20101111、20101201、20101224)中鹽酸小檗堿的含量分別為8.06、8.54、8.38 mg·g-1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果(n＝6)Tab 1Results of recovery tests(n＝6)

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

將鹽酸小檗堿對照品溶液在210～400 nm波長范圍內(nèi)進行光譜掃描，結(jié)果顯示其在230、265、345 nm波長處有較大吸收且吸收曲線平滑。綜合考慮并參考有關(guān)文獻[4，5]，選擇265 nm為檢測波長。

3.2 流動相的選擇

鹽酸小檗堿主要以陽離子形式存在，易與固定相中硅羥基較牢結(jié)合，形成拖尾。在考察了乙腈-水比例、十二烷基硫酸鈉濃度及流動相pH值對分離的影響后發(fā)現(xiàn)，將流動相調(diào)整為1.5 mmol·L-1十二烷基硫酸鈉溶液(以磷酸調(diào)pH 5.0)-乙腈(梯度洗脫)時分離情況良好，既避免了鹽酸小檗堿峰的拖尾現(xiàn)象，又使得樣品中各雜質(zhì)峰能與鹽酸小檗堿峰有效分離。

3.3 供試品制備方法考察

在參考相關(guān)文獻[6～8]的基礎(chǔ)上，對影響供試品溶液制備的主要因素[提取方法(加熱回流、超聲處理、連續(xù)回流提取)、提取時間(0.5、1.0、1.5 h)]進行了考察，最終優(yōu)化并確定了本文所述供試品溶液制備方法。

本試驗建立了以RP-HPLC法測定變通丸中鹽酸小檗堿含量的方法。試驗結(jié)果表明，本法簡便、快速、重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可用于變通丸的質(zhì)量控制。

[1]張軍會，左金丸不同配伍配比的臨床應(yīng)用[J].云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2007，30(4):49.

[2]楊威，金香蘭，于有華，等，黃連與吳茱萸配伍比例關(guān)系與功能關(guān)系的相關(guān)性分析[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2003，99(11):49.

[3]崔學(xué)軍，黃連及其有效成分的藥理研究進展[J].中國藥師，2006，9(5):469.

[4]盧榮枝，李嫦珍，李運景，等.RP-HPLC法測定婦潔洗劑中小檗堿的含量[J].中國藥房，2010，21(27):2539.

[5]蘇松柏，張永萍.采用高效液相色譜法測定黃連中鹽酸小檗堿含量[J].貴州中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2010，32(5):14.

[6]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典(一部)[S].2010年版.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:630.

[7]韓風(fēng)梅，李宇，李路軍，等.反相離子對液相色譜法測定左金丸中鹽酸小檗堿和吳茱萸次堿含量[J].分析化學(xué)，2005，33(11):166.

[8]李寧，韓風(fēng)梅，柳偉，等.反相高效液相色譜法測定加味左金丸中鹽酸小檗堿和吳茱萸次堿的含量[J].中國藥學(xué)雜志，2006，41(8):631.