唐斌斌，杜書君，孫德龍，郝保華(.山東陽谷縣人民醫(yī)院，陽谷縣5300；.西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西安市70069)

青風(fēng)藤味苦、辛，性平，歸肝、脾經(jīng)，具有祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)、利小便的功效，主要用于治療風(fēng)濕痹痛、關(guān)節(jié)腫痛、麻痹瘙癢[1]。其主要化學(xué)成分是以青藤堿為主的生物堿類，然而青藤堿口服生物利用度低、不良反應(yīng)多、需長期給藥。透皮給藥可以降低胃腸反應(yīng)，減少副作用，尤其是在電致孔條件下可以加大透皮給藥量和透皮速率[2，3]。目前，對于青風(fēng)藤體內(nèi)外透皮給藥的研究已有報(bào)道[4～7]，但未見體內(nèi)、外相關(guān)性的報(bào)道。本研究以青藤堿的透過量為考察指標(biāo)，評價電致孔不同電學(xué)參數(shù)組合下青藤堿提取液的體內(nèi)、外相關(guān)性，為以后進(jìn)一步研究提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

高效液相色譜(HPLC)儀，包括一元泵、自動進(jìn)樣器、在線脫氣機(jī)、柱溫箱、SPD-10Avp檢測器、2010色譜工作站(日本島津公司)；電致孔藥物導(dǎo)入儀(西北大學(xué)電子科學(xué)系)；改良的Franz雙室擴(kuò)散池(筆者自制)；78-1型磁力加熱攪拌器(江蘇金壇環(huán)宇科學(xué)儀器廠)；HL-2型橫流泵(鄭州南北儀器設(shè)備有限公司)；TGL-16型臺式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；活體透皮儀(筆者自制)；XK96-A型快速混勻器(江蘇姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司)；微量移液器(上海榮泰生化工程有限公司)。

1.2 試藥

青風(fēng)藤提取液(筆者自制，1 mL藥液相當(dāng)于0.5 g原藥材)；青藤堿對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:0774-200610)；肝素鈉(上海第一生化藥業(yè)有限公司，批號:060502)；甲醇(分析純，天津四友生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司，批號:071221101)；氯仿(分析純，東莞市東江化學(xué)試劑有限公司)。

1.3 動物

100只昆明種小鼠，♀♂兼半，重量(20±2)g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供(動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(軍)2002-006)。

2 方法與結(jié)果

2.1 電致孔不同電學(xué)參數(shù)組合方法

電致孔藥物導(dǎo)入儀的電學(xué)參數(shù)包括脈沖電壓、脈沖時間、脈沖波形、脈沖頻率和脈沖數(shù)。本文對電致孔的不同電學(xué)參數(shù)即脈沖時間(A)、脈沖電壓(B)、波形(C)、脈沖頻率(D)、脈沖數(shù)(E)按照L16(45)正交表安排試驗(yàn)。因素水平見表1。

表1 因素水平Tab 1Factors and levels

2.2 體外透皮實(shí)驗(yàn)

取體重合格的健康昆明種小鼠，脫頸處死，剪凈腹部的毛，然后剝離此處皮膚，小心剔除皮下脂肪組織，用蒸餾水沖洗干凈，選取角質(zhì)層完好的皮膚備用。將處理好的皮膚夾于雙室擴(kuò)散池中間，角質(zhì)層面向供給池，真皮層面向接受池；將惰性圓盤狀電極分別置于兩個池中(正負(fù)電極間隔1.0 cm)，正極在供給池，負(fù)極在接受池；供給池加入青風(fēng)藤提取液20 mL作為供給液，接受池中加入20 mL生理鹽水作為接受液。雙室擴(kuò)散池固定在調(diào)溫恒控磁力攪拌器上，以恒定速度攪拌，并保持恒溫在(32±0.5)℃。試驗(yàn)按照L16(45)正交表進(jìn)行，每次透皮時間為30 min，透皮給藥結(jié)束后取出全部接受液，快速混勻器上混勻1 min，在3000 r·min-1的條件下離心5 min，經(jīng)0.22μm微孔濾膜濾過，即得樣品。分別吸取樣品溶液20μL進(jìn)樣測定青藤堿含量。每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3 體內(nèi)透皮實(shí)驗(yàn)

取體重合格的健康昆明種小鼠，剪凈腹部的毛，選取皮膚完好者即用。將處理好的活體小鼠(腹部向上)固定在活體透皮儀的斜面上，將供給池放在擴(kuò)散池支撐裝置上并與小鼠腹部無毛區(qū)接觸，然后用活體透皮儀連接帶把活體小鼠和供給池固定牢固；保持供給池恒溫在(32±0.5)℃；在供給池中加入青風(fēng)藤提取液20 mL作為供給液，以活體小鼠作為接受池。試驗(yàn)按照L16(45)正交表進(jìn)行，每次透皮時間為30 min，透皮給藥結(jié)束后從小鼠眼眶取血0.5 mL，置肝素化的具塞離心管中，6000 r·min-1離心10 min，分離上層血清，加入0.1 mol·L-1的NaOH溶液0.2 mL混勻；用5 mL氯仿溶液萃取2次，合并萃取液，蒸干，用100μL甲醇溶解殘?jiān)?0μL進(jìn)樣測定青藤堿含量。每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 色譜條件

色譜柱:Diamonsil C1(8200 mm×4.6 mm，5μm)；流動相:甲醇∶(水-乙二胺＝300∶1)＝52∶48；檢測波長:262 nm；流速:1.0 mL·min-1。以青風(fēng)藤的主要成分青藤堿為指標(biāo)。

2.5 體外透皮實(shí)驗(yàn)方法學(xué)考察

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密稱取干燥至恒重的青藤堿對照品5.01 mg，置于50 mL容量瓶中，加流動相溶解并定容。精密吸取0.1、1.0、2.0、4.0、10.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，用流動相定容，得到系列濃度的對照品溶液。取上述溶液各20 μL，進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)，對照品濃度(X)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y＝3644.9X+1054.6(r＝0.9994)。結(jié)果表明，青藤堿檢測濃度在1.0～100.1 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好。

2.5.2 精密度試驗(yàn)參考線性范圍，配制濃度分別為1.0、50、100 μg·mL-1的青藤堿樣品，每次進(jìn)樣10 μL進(jìn)行含量測定。結(jié)果，日內(nèi)差異(1 d內(nèi)重復(fù)測定6次)，青藤堿含量RSD分別為1.26%、1.48%和1.35%；日間差異(每天測定1次，共測定6 d)，青藤堿含量RSD分別為1.81%、1.68%和1.61%。

2.5.3 回收率試驗(yàn)精密吸取已知含量的樣品，加入不同量的青藤堿對照品溶液，配制成高、中、低3個濃度，各進(jìn)樣10μL，每一濃度重復(fù)進(jìn)樣5次，測定峰面積，根據(jù)回歸方程計(jì)算青藤堿的含量。結(jié)果，3個濃度的平均回收率分別為98.84%、97.65%、99.02%，RSD分別為3.15%、3.28%、3.62%。

2.6 體內(nèi)透皮實(shí)驗(yàn)方法學(xué)考察

2.6.1 線性關(guān)系考察精密量取空白大鼠血漿0.2 mL，置于5 mL帶塞肝素化的離心管中。用流動相配制濃度為4.0、10.0、20.0、40.0、100.0μg·mL-1的青藤堿對照品溶液，分別吸取50μL加入空白大鼠血漿中混勻，再加入0.1 mol·L-1的NaOH溶液0.2 mL混勻；用5 mL氯仿溶液萃取2次，合并萃取液，蒸干，100μL甲醇溶解殘?jiān)?，?0μL進(jìn)樣測定含量。以峰面積積分值(A)為縱坐標(biāo)，對照品濃度(c)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為A＝0.0589c+2.3654(r＝0.9973)。結(jié)果表明，青藤堿檢測濃度在4.0～100.0 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好。

2.6.2 精密度試驗(yàn)參考線性范圍，配制濃度分別為4.0、10.0、20.0 μg·mL-1的青藤堿血漿對照品溶液，每次進(jìn)樣10 μL進(jìn)行含量測定。結(jié)果，日內(nèi)差異(1 d內(nèi)重復(fù)測定6次)，青藤堿含量RSD分別為5.1%、4.1%和4.9%；日間差異(每天測定1次，共測定6 d)，青藤堿含量RSD分別為5.6%、5.3%和6.1%。

2.6.3 回收率試驗(yàn)精密吸取已知含量的樣品，分別加入不同量的青藤堿血漿對照品溶液，配制成高、中、低3個濃度，各進(jìn)樣10μL，每一濃度重復(fù)進(jìn)樣5次，測定峰面積，根據(jù)回歸方程計(jì)算青藤堿的含量。結(jié)果，3個濃度的平均回收率分別為96.64%、97.12%、96.02%，RSD分別為4.15%、3.88%、3.72%。

3 結(jié)果

3.1 電致孔不同電學(xué)參數(shù)組合下體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)的青藤堿濃度

正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

3.2 體內(nèi)外透皮正交試驗(yàn)方差分析

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果見表3；體外實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果見表4。

由表3可知，因素A、B對電致孔透皮給藥有極顯著的影響，因素C對電致孔透皮給藥有顯著影響，因素D、E對電致孔透皮給藥無顯著的影響。選取顯著因素的最優(yōu)水平，得到體內(nèi)實(shí)驗(yàn)電致孔最優(yōu)電學(xué)參數(shù)條件為:A4B3C2D3E3，即脈沖時間1.3 ms、脈沖電壓300 V、波形為正弦波、脈沖頻率120個·min-1、脈沖數(shù)360個。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab 2Results of orthogonal tests

表3 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果Tab 3Analysis of variance of in vivo tests

表4 體外實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果Tab 4Analysis of variance of in vitro tests

由表4可知，因素A、B、C對電致孔透皮給藥有極顯著的影響，因素D、E對電致孔透皮給藥無顯著影響。選取顯著因素的最優(yōu)水平，得到體外實(shí)驗(yàn)電致孔最優(yōu)電學(xué)參數(shù)條件為A3B3C2D3E3，即脈沖時間1.2 ms、脈沖電壓300 V、波形為正弦波、脈沖頻率120個·min-1、脈沖數(shù)360個。

3.3 體內(nèi)外透皮給藥的相關(guān)性分析

將上述體外實(shí)驗(yàn)不同電致孔電學(xué)參數(shù)組合下青藤堿的透過濃度與對應(yīng)的電致孔電學(xué)參數(shù)組合下的體內(nèi)血藥濃度進(jìn)行線性回歸。以體外透過濃度(X)為橫坐標(biāo)，體內(nèi)血藥濃度(Y)為縱坐標(biāo)，得回歸方程為Y＝0.657518X－16.255(r＝0.9547)。對相關(guān)系數(shù)進(jìn)行顯著性檢查，計(jì)算統(tǒng)計(jì)量12.05；在顯著水平α＝0.001、自由度為10的條件下，查得。因?yàn)?，表明電致孔條件下青風(fēng)藤提取液體內(nèi)、外透皮實(shí)驗(yàn)的相關(guān)性非常顯著。

4 討論

電致孔可以顯著地促進(jìn)許多藥物的透皮吸收，故開發(fā)與電致孔相結(jié)合的新型透皮給藥系統(tǒng)引起了國內(nèi)、外藥學(xué)界的關(guān)注。由于體內(nèi)透皮研究難度較大，研究者往往利用體外實(shí)驗(yàn)來探索藥物的體內(nèi)透皮規(guī)律。然而只有在體內(nèi)、外透皮實(shí)驗(yàn)的相關(guān)性良好的情況下，體外實(shí)驗(yàn)研究數(shù)據(jù)才能真正反映出體內(nèi)的透皮規(guī)律。因此，需要進(jìn)行透皮給藥體內(nèi)、外相關(guān)性分析，考察體外實(shí)驗(yàn)?zāi)芊穹从乘幬锏捏w內(nèi)透皮規(guī)律。

本研究在基本保證實(shí)驗(yàn)條件一致的情況下，利用正交試驗(yàn)分別得到電致孔條件下青風(fēng)藤提取液體內(nèi)、外透皮實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)電學(xué)參數(shù)，比較發(fā)現(xiàn)二者只在脈沖時間上存在差異，差值僅為0.1 ms，可以忽略不計(jì)。因此，體外與體內(nèi)透皮實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)條件基本一致。接著對體內(nèi)、外透皮實(shí)驗(yàn)相關(guān)性進(jìn)行了分析，得到回歸方程為Y＝0.657518X－16.255(r＝0.9547)，由顯著性檢查可知體內(nèi)、外相關(guān)性非常顯著(α＝0.001)。因此，體外實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)基本能夠反映藥物的體內(nèi)透皮規(guī)律。

本研究方法具有一定的可行性，希望能夠?yàn)橐院蟮倪M(jìn)一步研究提供參考。由于體外測量數(shù)據(jù)明顯高于體內(nèi)數(shù)據(jù)，最高可達(dá)4.3倍，為了保證臨床用藥的安全性，體外優(yōu)化的電致孔參數(shù)組合還要結(jié)合體內(nèi)研究結(jié)果才能最終確定。

[1]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典(一部)[S].2010年版.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:181.

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