高永雙，孫安盛，何娜，吳芹，楊丹莉(1.廣東中山市第三人民醫(yī)院藥劑科，中山市58451；.遵義醫(yī)學院藥理學教研室/貴州省基礎藥理重點實驗室，遵義市563003)

心肌肥大是心肌對多種心血管刺激的適應性反應，早期具有代償意義，但長期的心肌肥大將發(fā)展為心力衰竭、心律失常和猝死[1]。心肌肥大發(fā)展成心衰是威脅公眾健康的一個嚴重問題，因此，對其發(fā)病機制和防治研究一直是重點關注課題。探討心肌肥大發(fā)病的分子機制可為其治療提供新的靶點，其中鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(Calcineurin，CaN)介導的信號通路在病理性心肌肥大的形成和發(fā)展中起重要調(diào)節(jié)作用[2]。吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸Euodia rutaecarpa(Juss.)Benth.)、石虎E.rutaecarpa(Juss.)Benth.var.officinalis(Dode)Huang或疏毛吳茱萸E.rutaecarpa(Juss).Benth.var.bodinieri(Dode)Huang的干燥近成熟果實，對神經(jīng)退行性疾病，如阿爾茨海默病的治療有很好的潛力，并可抑制腫瘤，在心血管系統(tǒng)方面具有廣泛的藥理作用[3]。遵義醫(yī)學院藥理學教研室近期研究表明，吳茱萸提取物(EV)具有抑制大鼠右心室肥大的作用。本研究通過野百合堿(Monocrotaline，MCT)所致大鼠右心室肥厚模型[4]，觀察EV對大鼠心肌肥大時CaN的影響。

1 儀器與材料

1.1 儀器

實時熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 試藥

EV(遵義醫(yī)學院植物化學教研室)；硝苯地平(Nif，山東新華制藥股份公司，批號:090625)；MCT、CaN和CaN催化亞基(calcineurin catalytic subunit，CnA)、兔抗大鼠多克隆抗體購自美國Sigma公司；羊抗兔免疫球蛋白G(IgG，二抗，北京中山金橋公司)；CaN引物(大連寶生物工程有限公司)；SYBR GREEN PCR Master Mix(英國ABI公司)。

1.3 動物

清潔級Wistar大鼠，月齡2～3月，♂，體重(200±20)g，由第三軍醫(yī)大學第三附屬醫(yī)院實驗動物中心提供(許可證號:SCXK(渝)2002008)。

2 方法

2.1 提取方法

吳茱萸粉碎成粗粉經(jīng)乙醇回流提取，回收乙醇，稠膏用乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯，得提取物。乙醇回流后的藥渣加水煎煮過濾，濃縮得濃縮液；萃取后的水溶液和濃縮液過濾，濾液用鹽酸調(diào)pH值至1.0～4.0。溶液中加NaCl使含量為5%～10%，攪拌使其溶解，靜置濾過，沉淀用水洗滌，調(diào)pH值至4.0～7.0，得提取物。與上述提取物合并，減壓干燥、粉碎即得樣品提取物，為粉末狀，臨用時蒸餾水溶解。

2.2 右室肥大模型的制備、分組和給藥

大鼠60只隨機分為正常對照(等體積生理鹽水)、模型(等體積生理鹽水)、Nif(20 mg·kg-1)和EV高、中、低劑量(200、100、50 mg·kg-1)組。正常對照組ip等容積生理鹽水，其余各組大鼠ip 2%MCT 60 mg·kg-1(MCT溶于1 mol·L-1鹽酸，調(diào)pH值至7.4)，連續(xù)18 d復制模型。模型復制開始24 h后ig給藥，給藥容積為1 mL·kg-1，每天1次，連續(xù)18 d。EV用0.2%羧甲基纖維素鈉助溶。

2.3 右心室肥大指數(shù)的測定

處死大鼠，稱體重(BW)后取出肺、完整心臟，去除血管和左、右心房，分離左、右心室，濾紙蘸干水分，稱取肺濕重(LW)、右心室濕重(RVW)和左心室加室間隔濕重[(LV+S)W]，計算右心室肥大指數(shù)(RVHI)＝RVW/(LV+S)W；右室相對重量(RI)＝RVW/BW和LW/BW。

2.4 實時定量PCR檢測心肌組織CaN mRNA的表達

按Trizol法提取心肌細胞總RNA，紫外分光光度計檢測A260/A280，比值在1.8～2.0范圍。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA并稀釋，進行聚合酶鏈反應。CaN正義鏈:ctgagatgctggtaaacgtcctga，反義鏈:tgctcggatcttgttcctgatg，擴增產(chǎn)物長度為122 bp；β肌動蛋白(β-actin)正義鏈:F-ggagattactgccctggct，反義鏈:R-gactcatcgtactcctgttgctg，擴增產(chǎn)物長度為150 bp。以β肌動蛋白為內(nèi)參照，用相對定量法計算CaN mRNA的表達水平。以循環(huán)閾值(Ct值)為統(tǒng)計參數(shù)，用目的基因表達/β-actin基因表達，對CaN mRNA進行相對定量。

2.5 免疫組化染色測定CnA蛋白表達

作心肌組織石蠟切片，進行常規(guī)免疫組化操作(ABC法)。即以抗生物素的過氧化物酶反應檢測，依次加入兔抗大鼠CnA多克隆抗體(一抗)、生物素標記的羊抗兔IgG(二抗)，DAB顯色、復染和封片。

2.6 統(tǒng)計學方法

實驗結(jié)果以±s表示，用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行ANOVA分析或t檢驗，進行統(tǒng)計學處理。

3 結(jié)果

3.1 EV對大鼠心室肥大的影響

與正常對照組比較，模型組于ip MCT 18 d后RVHI、RI分別增加了45.8%和38.0%；LW/BW增加近1倍。EV各給藥組與模型組比較，上述指標均明顯降低，且隨劑量增加作用呈增強趨勢。EV對模型大鼠RVHI、RI和LW/BW的影響見表1。

表1 EV對模型大鼠RVHI、RI和LW/BW的影響(±s，n＝10)Tab 1Effects of RVHI index，RI and LW/BW in model rats(±s，n＝10)

表1 EV對模型大鼠RVHI、RI和LW/BW的影響(±s，n＝10)Tab 1Effects of RVHI index，RI and LW/BW in model rats(±s，n＝10)

與正常對照組比較:＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與模型組比較:#P＜0.05，##P＜0.01vs.normal control group:＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.model group:#P＜0.05，##P＜0.01

組別正常對照組模型組EV低劑量組EV中劑量組EV高劑量組Nif組LW/BW/×10-4，g·g-1 48.4±7.3289.8±5.33＊81.2±5.76#80.3±6.03#75.9±8.05##73.8±7.21##劑量/mg·kg-1--5010020020 RVHI/g·g-1 0.24±0.020.35±0.04＊＊0.29±0.02#0.28±0.02#0.26±0.02##0.27±0.03#RI/×10-4，g·g-1 6.39±0.378.82±0.79＊8.29±0.66#8.10±1.07#7.01±0.63#7.31±0.92#

3.2 EV對大鼠心室肥大CaN mRNA表達的影響

與正常對照組比較，模型組CaN mRNA的表達增加了近8.9倍。高、中、低劑量EV給藥18 d后CaN mRNA的表達顯著降低，3個劑量間呈現(xiàn)較好的量效關系。EV對模型大鼠右室心肌細胞CaN mRNA表達的影響見表2。

表2 EV對模型大鼠右室心肌細胞CaN mRNA表達的影響(±s)Tab 2Effect of EV on the expression of CaN mRNA in RVH rats pretreated by MCT(±s)

表2 EV對模型大鼠右室心肌細胞CaN mRNA表達的影響(±s)Tab 2Effect of EV on the expression of CaN mRNA in RVH rats pretreated by MCT(±s)

與正常對照組比較:＊P＜0.01；與模型組比較:#P＜0.05，##P＜0.01vs.normal control group:＊P＜0.01；vs.model group:#P＜0.05，##P＜0.01

組別正常對照組模型組EV低劑量組EV中劑量組EV高劑量組Nif組CaN mRNA 100±37.2889±70.7＊507±79.2#391±103.7##178±59.1##251±82.2##劑量/mg·kg-1--5010020020 n444444

3.3 EV對大鼠心室CnA蛋白表達的影響

免疫組化檢測大鼠右心室CnA蛋白的表達顯示，與正常對照組比較，模型組心肌胞漿中陽性顆粒(棕色)增多，CnA呈高表達；與模型組比較，EV高劑量組心肌胞漿中陽性顆粒少，CnA表達明顯減少。免疫組化檢測大鼠右室心肌組織CnA蛋白的表達見圖1(設陰性對照)。

4 討論

心肌肥大最終導致心力衰竭，而心力衰竭在各種心血管疾病中死亡率占居首位[5]，故對其防治顯得尤為重要。MCT進入大鼠體內(nèi)代謝為野百合吡咯，后者損傷肺血管內(nèi)皮細胞，導致肺動脈血管平滑肌細胞增殖，引起肺動脈血管構(gòu)型重建而繼發(fā)右室肥大[6]，此模型被廣泛用于非原發(fā)于心臟的右心室肥厚和心力衰竭的研究。研究表明，ip MCT 60 mg·kg-118 d，模型組大鼠RVHI、RI和肺重/體重已呈明顯心肌肥厚重構(gòu)特征；同時，CaN mRNA的表達比正常對照組增加了近8.9倍，大鼠心室CnA蛋白質(zhì)的表達顯著增強。EV連續(xù)ig給藥18 d，各給藥組與模型組比較RVHI、RI和肺重/體重均見明顯減輕，心肌細胞CaN mRNA的表達明顯下調(diào)，CnA蛋白質(zhì)的表達明顯減弱，顯示EV對MCT誘發(fā)的大鼠右室肥大產(chǎn)生了明顯的抑制作用。

在心肌肥大過程中，Ca2+-CaN-去磷酸化胞漿中的轉(zhuǎn)移核因子(NFAT)信號通路起著至關重要的作用。CaN是由一個CnA和一個調(diào)節(jié)亞基(CnB)組成的異源二聚體，CnA尤其是CaNAβ亞型在心肌肥大中發(fā)揮著重要作用[7]。激活的CaN通過NFAT3進入細胞核，結(jié)合基因GATA4，一起啟動心肌細胞肥大基因(肌肉介導心鈉素、肌球蛋白輕鏈-2和胎兒β-原肌球蛋白等)表達，最后導致心肌肥大形成；抑制CaN的活性可減輕心肌肥大[8]。研究表明，模型組CaN mRNA和CnA的蛋白表達水平均顯著增高，EV對其產(chǎn)生明顯的抑制作用，表明EV抗心肌肥大作用可能與其抑制CaN有關。

[1]Berenji K，Drazner MH，Rothermel BA，et al.Does loadinduced ventricular hypertrophy progress to systolic heart failure?[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2005，289(1):H8.

[2]戴文建，王以光.心肌肥厚分子機制研究進展[J].心血管病學進展，2009，30(1):47.

[3]龔慕辛，王智民，張啟偉，等.吳茱萸有效成分的藥理研究進展[J].中藥新藥與臨床藥理，2009，20(2):183.

[4]高永雙，何娜，吳芹，等.吳茱萸提取物抑制野百合堿所致右心室肥厚的實驗研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2010，21(1):144.

[5]Kannel WB.Vital epidemiologic clues in heart failure[J].J Clin Epidemiol，2000，53(3):229.

[6]Boor PJ，Gotlieb AI，Joseph EC，et al.Chemical-induce vasculature injury[J].Toxicol Appl Pharmacol，1995，132(2):177.

[7]Bueno OF，Wilkins BJ，Tymitz KM，et al.Impaired cardiac hypertrophic response in Calcineurin Abeta-deficient mice[J].Proc Natl Acad Sci USA，2002，99(7):4586.

[8]Heineke J，Molkentin JD.Regulation of cardiac hypertrophy by intracellular signalling pathways[J].Nat Rev Mol Cell Biol，2006，7(8):589.