葉英杰，李楠，陳祝君，向小飛，黃亮，鄒文銓，楊明，3(.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，成都市637；2.四川大學(xué)華西藥學(xué)院，成都市6004；3.江西中醫(yī)學(xué)院中藥現(xiàn)代制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌市330004)

黃芩苷屬黃酮類化合物，具有多項(xiàng)藥理作用，臨床應(yīng)用廣泛。由于其具有清除自由基、抗氧化、抗炎、對(duì)抗興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞、抗各種腦水腫及抗缺血再灌注損傷等作用，用于治療缺血性腦血管疾病已成為臨床研究的熱點(diǎn)[1]。但因其脂溶性、水溶性差等原因造成體內(nèi)吸收差、生物利用度低、藥效不穩(wěn)定，從而限制了藥效的充分發(fā)揮[2]。為了改善這一情況，提高黃芩苷的生物利用度，前人研制了黃芩苷磷脂復(fù)合物以改善其理化性質(zhì)，從而改善體內(nèi)吸收情況[3]。

鼻腔給藥系統(tǒng)是一種新型的給藥系統(tǒng)，通過(guò)鼻腔給藥，藥物可繞過(guò)血腦屏障而入腦，有望成為靜脈注射的替代給藥途徑。鼻用溫敏型原位凝膠(Nasal in-situ gel)能霧化使以溶液狀態(tài)給藥，易于到達(dá)鼻黏膜，利用鼻腔特殊的環(huán)境溫度(32～34℃)，使得在鼻腔中及時(shí)發(fā)生相轉(zhuǎn)變而形成凝膠，黏附于黏膜表面，延長(zhǎng)在鼻腔的保留時(shí)間，達(dá)到緩釋長(zhǎng)效的目的，且能減少藥物流失，增加藥物吸收，有利于藥物經(jīng)鼻向腦轉(zhuǎn)運(yùn)[4～7]。因此，在黃芩苷磷脂復(fù)合物的基礎(chǔ)上研制了黃芩苷磷脂復(fù)合物鼻用溫敏型原位凝膠，以擴(kuò)大臨床應(yīng)用。

Franz擴(kuò)散池主要應(yīng)用于體外藥物滲透性試驗(yàn)，模擬體內(nèi)生理情況對(duì)藥物的膜滲透性進(jìn)行評(píng)價(jià)[7]。本文通過(guò)體外鼻黏膜滲透性試驗(yàn)比較了黃芩苷磷脂復(fù)合物溶液、黃芩苷溶液和3種不同處方的黃芩苷磷脂復(fù)合物的鼻用溫敏型原位凝膠的鼻黏膜滲透性，確定了黃芩苷磷脂復(fù)合物、黃芩苷溶液和黃芩苷磷脂復(fù)合物鼻用溫敏型凝膠的體外釋藥曲線，并對(duì)黃芩苷磷脂復(fù)合物鼻用溫敏型凝膠的處方進(jìn)行了篩選。

1 儀器與材料

1.1 儀器

85-2型數(shù)顯恒溫磁力攪拌器(上海金鵬分析儀器有限公司)；FA1104型電子天平(上海精科儀器廠)；BP211D型電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；TGL-16G型高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器有限公司)；戴安高效液相色譜(HPLC)儀，包括P680四元泵、TCC-100型柱溫箱、ASI-100型自動(dòng)進(jìn)樣器、UVD170U型紫外檢測(cè)器(戴安中國(guó)有限公司)；Franz擴(kuò)散池(筆者自制)。

1.2 試藥

黃芩苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):110715-200514)；黃芩苷提取物(筆者自制，含量:85%)；大豆卵磷脂(成都科龍化工試劑廠，批號(hào):S20020037，含氮量:＞99.8%)；甘露醇(成都科龍化工試劑廠，批號(hào):000308)；PEG6000(廣州市化學(xué)試劑玻璃儀器批發(fā)部，批號(hào):911128)；三乙醇胺(成都科龍化工試劑廠，批號(hào):000258)；生理鹽水(四川科倫藥業(yè)股份有限公司，批號(hào):060221502)；甲醇為色譜純，水為重蒸餾水，其余試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物

豬，♀♂兼用，體重(70±5)kg，由四川省成都市溫江區(qū)天府鎮(zhèn)屠宰場(chǎng)提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃芩苷分析方法的建立[8]

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜柱:Kromasil C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相:甲醇-水-磷酸(47∶53∶0.2)；流速:1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng):280 nm；柱溫:40℃；進(jìn)樣量:40 μL。理論板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2000。

2.1.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定取黃芩苷對(duì)照品溶液及供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，在檢測(cè)器上進(jìn)行紫外掃描(200～350 nm)。結(jié)果表明，黃芩苷對(duì)照品溶液及供試品溶液在280 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故選擇280 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密稱取黃芩苷對(duì)照品適量，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得310 μg·mL-1的對(duì)照品貯備液。取1 mL置于10 mL量瓶中，用生理鹽水稀釋至刻度，配制成31 μg·mL-1的對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣1、2、4、8、16、32 μL，記錄色譜圖。以黃芩苷進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y＝45.405X+0.0513(r＝0.9999)。結(jié)果表明，黃芩苷進(jìn)樣量在0.031～0.992 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好。

2.1.4 回收率試驗(yàn)按“2.1.3”項(xiàng)下方法操作，制備高、中、低濃度的黃芩苷樣品溶液，測(cè)定其峰面積，依據(jù)外標(biāo)法計(jì)算濃度，測(cè)得平均回收率為(100.07±2.6)%，其RSD＜2%。

2.1.5 精密度試驗(yàn)按“2.1.3”項(xiàng)下方法操作，選擇高、低濃度的黃芩苷溶液，分別于1 d內(nèi)重復(fù)測(cè)定5次，得日內(nèi)RSD均＜2%；連續(xù)5 d測(cè)定，得日間RSD均＜2%。

2.2 黃芩苷磷脂復(fù)合物的制備

黃芩苷和大豆卵磷脂的投物料比為1∶2(W/W)，加入一定體積的四氫呋喃為溶劑，使黃芩苷藥物濃度為2.5 mg·mL-1，在55～60℃恒溫水浴中以120 r·min-1磁力攪拌1 h，減壓回收溶劑，真空干燥，即得黃芩苷磷脂復(fù)合物。將制備好的黃芩苷磷脂復(fù)合物加入適量的氯仿，充分溶解其中的磷脂及復(fù)合物，收集沉淀，干燥，即得黃芩苷磷脂復(fù)合物粉末。HPLC法測(cè)得復(fù)合物中黃芩苷的含量為30%。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 黃芩苷溶液精密稱取黃芩苷0.033 g，于pH 5.8的磷酸鹽緩沖溶液中研磨溶解，定容至10 mL，即得。

2.3.2 黃芩苷凝脂復(fù)合物溶液精密稱取黃芩苷凝脂復(fù)合物0.1 g，于pH 5.8的磷酸鹽緩沖溶液中研磨溶解，置于10 mL容量瓶中，以pH 7.4磷酸鹽緩沖溶液定容至10 mL，3000 r·min-1離心10 min后取上清液，即得。

2.3.3 黃芩苷磷脂復(fù)合物鼻用溫敏型原位凝膠根據(jù)各處方精密稱取藥物，先將黃芩苷置研缽中，加入適量的三乙醇胺溶液(0.1%)研磨溶解，將溶液轉(zhuǎn)移至西林瓶中，分次用三乙醇胺溶液洗滌，將洗滌液合并至西林瓶中后加入其他輔料。將西林瓶置冰浴4℃磁力攪拌下使其分散均勻，置4℃冰箱中保存24 h，直至聚合物完全溶解得到澄明溶液。

黃芩苷凝膠膠凝溫度的測(cè)定:將溫度計(jì)插入裝有黃芩苷凝膠的西林瓶中，同時(shí)加入攪拌石，開啟數(shù)顯恒溫磁力攪拌器，緩慢升溫，直到攪拌石不再轉(zhuǎn)動(dòng)，立即停止，讀出溫度計(jì)上的數(shù)字，即為黃芩苷凝膠膠凝溫度。選擇膠凝溫度為30～35℃之間的凝膠進(jìn)行黏膜滲透試驗(yàn)。黃芩苷凝膠各處方藥物含量見表1(加三乙醇胺水溶液至10 g)。

表1 黃芩苷凝膠各處方藥物含量Tab 1The drug content of each prescription of baicalin gel

2.4 試驗(yàn)操作與裝置[9]

將死亡2 h內(nèi)的豬鼻部取下，切開鼻腔，暴露出鼻中隔及兩側(cè)鼻甲骨，用一個(gè)圓頭的細(xì)玻璃棒及鑷子將覆蓋在其上的鼻腔薄膜小心剝離，用生理鹽水洗凈薄膜上殘留的血跡，再將薄膜放在一片鋁箔上，鋪開，立即使用。

本試驗(yàn)采用Franz擴(kuò)散池法，裝置分為兩部分，即供給室與接受室，有效擴(kuò)散面積為3.14 cm2，接受池容積為14 mL。在Franz擴(kuò)散池接受室內(nèi)加入電磁攪拌子(長(zhǎng)為0.9 cm，寬為0.4 cm)和氯化鈉溶液14 mL，并及時(shí)排出氣泡。將豬鼻黏膜層固定在接受室和供給室之間，置于水浴溫度35～37℃、3000 r·min-1的恒溫磁力攪拌器上，平衡20 min。用1 mL移液管加入1 mL藥液均勻覆蓋供給室豬鼻黏膜上，分別于15、30、45、60、90、120、150、180、240、300 min各取樣1 mL，每次取樣后補(bǔ)足氯化鈉溶液1 mL。10000 r·min-1離心5 min后取上清液，作為樣品溶液。按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件操作，進(jìn)樣量為40μL。HPLC法測(cè)定樣品中黃芩苷的濃度，計(jì)算單位面積累積滲透量()和穩(wěn)態(tài)透膜速率(Js)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

根據(jù)下列公式計(jì)算各個(gè)時(shí)間點(diǎn)黃芩苷磷脂復(fù)合物的μg·cm-2):

式中，V為Franz擴(kuò)散池接收室的體積(14 mL)；A為Franz擴(kuò)散池有效擴(kuò)散面積(3.14 cm2)；Cn為第n次取樣時(shí)接受液的濃度；Ci為第i次取樣時(shí)接受液的濃度；ΣCiVi為取樣所損失藥量的累積和。

將以上各樣品的對(duì)滲透時(shí)間t進(jìn)行回歸處理，直線斜率即為J(sμg·cm-2·h-1):

2.6 體外滲透率試驗(yàn)結(jié)果

不同時(shí)間段的見表2；不同時(shí)間段單位面積釋藥曲線見圖1；每種樣品Js值(μg·cm-2·h-1)柱形比較見圖2。

表2 不同時(shí)間段的QTab 2Accumulated release amount per unit area in different time

圖1 不同時(shí)間段單位面積釋藥曲線Fig 1drug release curves per unit area in different time

圖2 每種樣品Js值(μg·cm-2·h-1)柱形比較圖Fig 2Column comparison chart of Jsvalue of each sample(μg·cm-2·h-1)

由表2、圖1可知，5種被測(cè)樣品均能透過(guò)豬鼻黏膜，且黃芩苷磷脂復(fù)合物溶液在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)透過(guò)的濃度最高。前15 min每個(gè)樣品的接受池中均檢測(cè)不到黃芩苷，證明每個(gè)樣品在滲透時(shí)均有一定的滯留時(shí)間。藥物的對(duì)時(shí)間呈良好的線性關(guān)系，符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程。最后300 min的為黃芩苷磷脂復(fù)合物＞處方二＞處方一＞處方三＞黃芩苷溶液。黃芩苷凝膠3個(gè)不同的處方在15～90 min時(shí)滲透量差異不大，但在90 min后處方二的優(yōu)勢(shì)較為明顯。由圖2可看出，各個(gè)樣品的Js值大小仍為黃芩苷磷脂復(fù)合物＞處方二＞處方三＞處方一＞黃芩苷溶液。

3 討論

在體外透膜或透皮試驗(yàn)過(guò)程中，接受液的選擇十分重要。為了更確切地描述體內(nèi)過(guò)程，接受液應(yīng)具有接受透膜或透皮藥物的能力，并盡可能地符合類似體內(nèi)的漏槽條件。常用的接受液有生理鹽水、林格氏液和等滲的磷酸鹽緩沖液等[10]。本研究前期試驗(yàn)中以主藥溶解性能為依據(jù)，對(duì)生理鹽水與pH 5.8、pH 6.5的磷脂緩沖液及加入促滲透劑乙醇、PEG400進(jìn)行溶解性測(cè)定，直接測(cè)定黃芩苷在不同接受液中的飽和濃度，最后選擇生理鹽水為接受液。

有研究發(fā)現(xiàn)在采用體外豬鼻黏膜的滲透池?cái)U(kuò)散試驗(yàn)時(shí)，離體的豬鼻黏膜在8 h內(nèi)可保持生理活性[11，12]。因此，在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中可保證所有離體鼻黏膜組織和生理上的完整性避免誤差。試驗(yàn)設(shè)計(jì)各個(gè)樣品中所含黃芩苷濃度一致，從而可避免藥物濃度的差異對(duì)滲透過(guò)程的干擾。試驗(yàn)中選擇嗅區(qū)鼻黏膜以盡量模擬體內(nèi)鼻腔給藥形式，因?yàn)椤氨?腦”通路主要是通過(guò)嗅區(qū)黏膜的吸收而直接入腦。

黃芩苷磷脂復(fù)合物溶液的和Js都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于黃芩苷溶液。黃芩苷制成磷脂復(fù)合物后其水溶性和脂溶性都得到極大的改善是造成這一現(xiàn)象的主要原因。因?yàn)辄S芩苷磷脂復(fù)合物在水中溶解量是黃芩苷的4.56倍；在正辛醇中，其溶解量約是黃芩苷的70.17倍。復(fù)合物溶液同凝膠劑的比較中，由于凝膠基質(zhì)會(huì)影響藥物的釋放導(dǎo)致凝膠劑的和Js都低于黃芩苷磷脂復(fù)合物溶液。但是，由于溶液劑給藥后，患者的吞咽過(guò)程會(huì)造成藥物流失過(guò)多且患者順應(yīng)性較差；而溫敏型凝膠由于鼻腔的溫度而發(fā)生膠凝形成凝膠黏附于鼻黏膜上，大大減少了藥物的損失，同時(shí)患者也容易接受，更加適用于鼻腔給藥。由黃芩苷凝膠3種處方的試驗(yàn)結(jié)果比較可見，處方二的和Js都最高，所以選擇處方二為最佳處方。

[1]Lee H，Yang LL，Wang CC，et al.Differential effects of natural polyphenols on neuronal survival in primary cultured central neurons against glutamate and glucose deprivation-induced neuronal death[J].Brain Res，2003，986(103):113.

[2]Wang YY.Advances in research of baicalin absorption and pharmacokinetics[J].Chinese Journal of Current Practical Medicine，2005，4(9):44.

[3]許潤(rùn)春，林彥君，吳品江，等.黃芩苷磷脂復(fù)合物理化性質(zhì)的研究[J].中成藥，2008，30(6):934.

[4]Vadnere M，Amidon G，Haslam J，et al.Thennodynamic studies on the gel-sol transition of some pluronic polyols[J].Int J Pharm，1984，23(3):231.

[5]Ricci EJ，Lunardi LO，Nanclares DMA，et al.Sustained release of lidocaine from Poloxamer 407 gels[J].Int J Pharm，2005，288(2):235.

[6]萬(wàn)麗麗，郭澄.中藥藥動(dòng)學(xué)研究現(xiàn)狀和研究方向[J].中國(guó)藥房，2006，17(8):627.

[7]徐傳新，申獻(xiàn)玲，王宗喜，等.美洛昔康溫敏性水凝膠的處方設(shè)計(jì)和含量測(cè)定[J].藥物制劑，2008，27(12):3.

[8]蔡錚，候世祥，宋相容，等.天麻素離子敏感鼻用原位凝膠體外釋放研究[J].中國(guó)中藥雜志，2008，33(7):3.

[9]吳品江，魏萍，林彥君，等.黃芩苷載藥體系鼻黏膜滲透性及鼻腔纖毛毒性研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2009，44(4):6.

[10]何群，黃海兵，郭建生，等.頸瘤康貼膏劑體外釋放、透皮試驗(yàn)研究[J].中成藥，2008，30(2):201.

[11]陸彬.藥物新劑型與新技術(shù)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，1998:379.

[12]Cecilia Wadell，Erik Bjo¨rk，Ola Camber.Nasal drug delivery-evaluation of an in vitro model using porcine nasal mucosa[J].Eur J Pharm Sci，1999，7(3):197.