張青，徐群為，黃長高，都述虎(南京醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南京市210029)

左氧氟沙星(LOFL)為氧氟沙星的左旋活性異構(gòu)體，屬第3代氟喹諾酮類廣譜抗菌藥物，通過抑制細(xì)菌DNA回旋酶，對大多數(shù)革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均有顯著的殺菌作用，對非典型病原體也有較好的抗菌作用[1]。目前，LOFL遞藥系統(tǒng)主要有普通注射劑、滴眼劑、片劑和膠囊劑，但這些劑型的缺陷是藥物進入體內(nèi)后消除較快，而緩釋制劑比普通制劑能更長時間維持LOFL的有效濃度，所以很多學(xué)者在研究LOFL的緩釋劑型[2，3]。

酪蛋白(Cas)是主要從牛奶中提取的一種混合蛋白質(zhì)，根據(jù)編碼基因不同，分為αs1、αs2、β、κ 4種組分[4]，其質(zhì)量比為4∶1∶4∶1，平均等電點為4.8，已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于食品、化妝品的處方中[5]，具有高乳化性、穩(wěn)定性、膠凝性及生物相容性[6]。因為Cas具有親水和親脂的氨基酸殘基，所以在溶液中能自發(fā)組裝成膠束[7]，并且其可以與戊二醛發(fā)生交聯(lián)，形成生物可降解的、具有緩控釋能力的微球[8]。以Cas為載體材料制備的藥物傳輸系統(tǒng)，不僅具有生物可降解性，而且具有藥物緩控釋能力，有良好的研究前景[8，9]。

本文通過熒光光譜技術(shù)，研究LOFL與Cas的相互作用，推斷其作用機制，計算得到結(jié)合常數(shù)和相關(guān)熱力學(xué)參數(shù)。本研究可為制備以Cas為載體材料的LOFL遞藥系統(tǒng)提供緩釋機制、藥物載體比例、穩(wěn)定性等方面的理論基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

F4600型熒光光度計(日本Hitachi公司)；Delta 320-S pH計(瑞士Mettler-Toledo公司)；AY220型電子天平(日本Shimadzu公司)；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；PURELABTMCLASSIC超純水機(德國Pall公司)。

1.2 試藥

LOFL(乳酸鹽，上海三維制藥有限公司，批號:200510124，純度:99%)；Cas(酪蛋白酸鈉，百靈威科技有限公司，批號:C0594，純度:90%)；所有樣品溶液均用氯化鈉溶液調(diào)節(jié)離子強度為0.1 mol·L－1；試劑均為分析純，試驗用水為超純水。

2 方法

2.1 熒光光譜的研究

為了考察研究對象的熒光發(fā)射光譜是否相互干擾，記錄了各單一組分的熒光發(fā)射光譜。在緩沖液(三羥甲基氨基甲烷-鹽酸，Tris-HCl)中160 W功率下超聲10 min，溶解Cas，制備成2 g·L－1的貯備液；LOFL在緩沖液中制備成1.0×10－4mol·L－1的貯備液，均置于冰箱中1～4℃保存。取Cas貯備液1 mL和LOFL貯備液0.5 mL，分別置于10 mL容量瓶中，用緩沖液定容，搖勻，掃描熒光光譜。預(yù)試驗測得LOFL和Cas的激發(fā)/發(fā)射波長分別為285/461 nm和278/340 nm。設(shè)定激發(fā)波長為285 nm，掃描發(fā)射波長范圍295～700 nm，掃描速度為1200 nm·min－1，激發(fā)和發(fā)射光狹縫寬度分別為10 nm和5 nm，光電倍增管(PMT)電壓為400 V，記錄0.2 g·L－1的Cas溶液、5×10－5mol·L－1的LOFL溶液和緩沖液的熒光光譜。

2.2 熒光猝滅試驗

熒光猝滅試驗可以推斷分子間相互作用的機制，計算相互作用的熱力學(xué)參數(shù)以及分子結(jié)合位點數(shù)[10～12]。在編號為0～8號的10 mL的容量瓶中，均加入1.0 mL的Cas貯備液，然后分別加入0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL的LOFL貯備液，用pH7.4的緩沖液稀釋至刻度，混合均勻，于恒溫水浴鍋中保溫1 h，得到0～8號樣品。其中Cas濃度均為0.2 g·L－1，LOFL濃度分別為0、0.2×10－5、0.3×10－5、0.4×10－5、0.5×10－5、0.6×10－5、0.7×10－5、0.8×10－5、0.9×10－5mol·L－1。分別在25℃和30℃2種溫度下記錄各樣品的熒光光譜。從熒光光譜中可以得到在不含或含不同濃度的LOFL情況下，Cas在最大發(fā)射波長處的熒光強度。

熒光猝滅的機制分為動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅。動態(tài)猝滅是熒光分子在擴散中遭遇猝滅劑而發(fā)生的碰撞猝滅；靜態(tài)猝滅是熒光分子與猝滅劑之間形成了基態(tài)復(fù)合物引起的熒光猝滅[12]。如果猝滅機制是動態(tài)猝滅，熒光猝滅過程遵循Stern-Volmer方程[13]，見方程(1):

式中，F(xiàn)0和F分別代表不存在和存在猝滅劑時最大發(fā)射波長處的熒光強度；kq為生物分子猝滅速率常數(shù)；τ0是無猝滅劑存在時熒光體的熒光壽命，對于生物大分子而言，τ0＝10－8s；[Q]為猝滅劑濃度；Ksv是Stern-Volmer猝滅常數(shù)。

對于靜態(tài)猝滅，可用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)函數(shù)關(guān)系式擬合:

式中，KLB是靜態(tài)猝滅結(jié)合常數(shù)[13]。

對于靜態(tài)猝滅，熒光強度與猝滅劑濃度間存在方程(3)所描述的關(guān)系，可以用來確定結(jié)合位點數(shù)和結(jié)合常數(shù)[10]。

式中，Kb為結(jié)合常數(shù)，n為結(jié)合位點數(shù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 熒光光譜

分別對0.2 g·L－1的Cas溶液、0.5×10－5mol·L－1的LOFL溶液、緩沖液在285 nm波長處激發(fā)，記錄發(fā)射光譜。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Cas的最大發(fā)射波長在340 nm處；LOFL的最大發(fā)射波長為461 nm；而緩沖液和LOFL溶液在340 nm波長處幾乎未見發(fā)射熒光峰，所以不會對Cas溶液產(chǎn)生的熒光造成干擾，見圖1。

圖1 3種溶液的熒光光譜Fig 1Fluorescence spectra of 3 kinds of solutions

圖2 LOFL對Cas的熒光猝滅光譜Fig 2Effect of LOFL on fluorescence spectra of Cas

3.2 LOFL對Cas的熒光猝滅作用

蛋白質(zhì)是熒光體，內(nèi)源性熒光主要來自于色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)等氨基酸殘基，在280 nm波長附近激發(fā)，其熒光峰分別位于348、303、282 nm波長處，強度比為Trp∶Tyr∶Phe＝100∶9∶0.5[10，11]。Cas的最大發(fā)射波長在340 nm處，所以可以判斷Cas的熒光主要來自于Trp殘基。與熒光物質(zhì)相互作用導(dǎo)致熒光強度下降或者能使熒光量子產(chǎn)率降低的物質(zhì)稱為熒光猝滅劑，LOFL對Cas的熒光猝滅光譜詳見圖2(圖中0→8指依次為0～8號樣品)。

由圖2可以發(fā)現(xiàn)，LOFL是Cas的熒光猝滅劑。固定Cas濃度，不斷提高混合溶液中LOFL的濃度，結(jié)果Cas的熒光有規(guī)律地猝滅。對于LOFL，隨著其濃度升高，在461 nm波長處的熒光強度逐漸增強，在394.8 nm波長處出現(xiàn)了1個等強度發(fā)射點，提示藥物與蛋白之間形成了穩(wěn)定的復(fù)合物。

3.3 猝滅機制的推斷和相關(guān)熱力學(xué)參數(shù)的計算

圖3 2種溫度下LOFL與Cas相互作用的Stern-Volmer曲線Fig 3Stern-Volmer plots for the interaction between LOFL and Cas at 2 kinds of temperatures

對于動態(tài)猝滅而言，由于猝滅劑對生物大分子的最大擴散控制的碰撞猝滅速率常數(shù)為2.0×1010L·mol－1·s－1，如果計算出的kq值小于2.0×1010L·mol－1·s－1，表明該猝滅過程是分子擴散和碰撞引起的動態(tài)猝滅。如果計算出的kq值遠(yuǎn)大于2.0×1010L·mol－1·s－1，則表明該猝滅過程是分子之間形成了基態(tài)復(fù)合物引起的靜態(tài)猝滅。另外，溫度對Ksv值的影響也可以幫助區(qū)分動態(tài)和靜態(tài)猝滅。動態(tài)猝滅過程中，當(dāng)溫度升高，分子間碰撞加劇，Ksv值變大；靜態(tài)猝滅過程中，溫度升高，基態(tài)復(fù)合物穩(wěn)定性下降，Ksv值變小[12]。為了推測熒光猝滅機制，分別在25℃和30℃2個溫度下測定熒光猝滅情況，從熒光光譜中可以得到F0和F值，以F0/F對[Q]作圖，得到圖3。根據(jù)圖3中的曲線，應(yīng)用Stern-Volmer方程擬合的參數(shù)見表1。

圖4 2種溫度下LOFL與Cas相互作用的Lineweaver-Burk曲線Fig 4Lineweaver-Burk quenching plots for the interaction between LOFL and Cas at 2 kinds of temperatures

表1 LOFL與Cas相互作用的Stern-Volmer常數(shù)和曲線擬合方程Tab 1Stern-Volmer quenching constants and curves fitted equation of interaction between LOFLand Cas

從表1中發(fā)現(xiàn)，計算得到的kq值遠(yuǎn)大于2.0×10－10L·mol－1·s－1，所以可推斷猝滅過程是靜態(tài)猝滅；進一步發(fā)現(xiàn)隨著溫度升高，Ksv值變小，這一結(jié)果也證明了猝滅過程是靜態(tài)猝滅而不是動態(tài)猝滅過程。

所以采用靜態(tài)猝滅模型對數(shù)據(jù)進行擬合。根據(jù)方程(2)對25℃和30℃2種溫度下的熒光猝滅數(shù)據(jù)進行分析，擬合曲線見圖4。

從圖4中發(fā)現(xiàn)曲線的線性關(guān)系良好，從斜率可以計算得到相應(yīng)溫度下的KLB值，KLB近似于熱力學(xué)結(jié)合常數(shù)K[13]。結(jié)合KLB值與相關(guān)熱力學(xué)公式(4)、(5)，可以計算得到相關(guān)熱力學(xué)參數(shù)，見表2。

式中，ΔG為自由能，ΔH為標(biāo)準(zhǔn)焓，ΔS為標(biāo)準(zhǔn)熵，R為氣體常數(shù)，T為絕對溫度。

表2 LOFL與Cas相互作用的Lineweaver-Burk猝滅常數(shù)、曲線擬合方程和相關(guān)熱力學(xué)參數(shù)Tab 2Lineweaver-Burk quenching constant KLB，curves fitted equation and the relative thermodynamic parameters of the interaction between LOFLand Cas

從表2中可以發(fā)現(xiàn)，KLB值隨著溫度的升高而變小，與KSV值隨溫度的變化是一致的，說明溫度升高后降低了LOFL與Cas之間的相互作用。蛋白質(zhì)與小分子之間的非共價鍵相互作用包括4種類型，分別是范德華力、氫鍵、疏水作用和靜電作用[14]。ΔG、ΔH和ΔS能夠反映相互作用模式。當(dāng)溫度變化較小時，ΔH可以看作是常數(shù)，ΔH是負(fù)值顯示反應(yīng)是放熱過程；ΔG為負(fù)值表示反應(yīng)是自發(fā)過程。對于典型的疏水作用，ΔH和ΔS都是正值；當(dāng)焓變和熵變都是負(fù)值表示主要存在范德華力以及形成了氫鍵[15]。測得LOFL與Cas結(jié)合的ΔH和ΔS分別為－39.85 kJ·mol－1和－48.54 J·mol－1·K－1，所以推斷LOFL與Cas之間的相互作用主要是范德華力和氫鍵。

圖5 2種溫度下lg[(F0－F)/F]-lg[Q]關(guān)系曲線Fig 5Plots of the interaction between lg[(F0－F)/F]and lg[Q]at 2 kinds of temperatures

3.4 結(jié)合位點數(shù)確定

將25℃和30℃2種溫度下測定的熒光猝滅數(shù)據(jù)用公式(3)擬合，得到圖5。

從圖5中直線的斜率可以得到結(jié)合位點數(shù)。計算得到平均結(jié)合位點數(shù)n＝1.38，即LOFL與Cas分子以接近1∶1的比例發(fā)生相互作用。

4 討論

對LOFL與Cas存在相互作用的研究，對制備藥物傳輸系統(tǒng)有一定幫助。例如載體和藥物的作用位點數(shù)，可以指導(dǎo)確定藥物和載體的比例，以優(yōu)化載藥量和包封率。載體和藥物存在相互作用，可以提高藥物的穩(wěn)定性，而且大幅提高藥物的緩釋性能[16，17]；另外相互作用類型可以為設(shè)計刺激敏感型藥物傳輸系統(tǒng)提供理論指導(dǎo)[18]。

本文利用熒光光譜研究了LOFL與Cas之間的相互作用。發(fā)現(xiàn)LOFL對Cas的內(nèi)源性熒光具有猝滅作用。根據(jù)熒光猝滅數(shù)據(jù)推斷猝滅機制屬于靜態(tài)猝滅而不是動態(tài)猝滅。計算了不同溫度下的靜態(tài)熒光猝滅結(jié)合常數(shù)，結(jié)合熱力學(xué)方程，計算得到相關(guān)熱力學(xué)參數(shù)。結(jié)果提示二者的相互作用是以氫鍵和范德華力為主，二者以接近1∶1的比例發(fā)生相互作用。

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