劉 淵 卞兆連 韓小鳳 王綺夏 邱德凱 馬 雄

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院消化內(nèi)科 上海市消化疾病研究所（200001）

自身免疫性肝炎（AIH）是由異常自身免疫反應(yīng)介導(dǎo)的肝實(shí)質(zhì)炎癥性病變，以高丙種球蛋白血癥、血清自身抗體陽性和對(duì)免疫抑制治療有應(yīng)答為特點(diǎn)[1,2]，其病因和發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚。大量研究發(fā)現(xiàn)AIH患者肝臟內(nèi)有大量激活的淋巴細(xì)胞浸潤，并分泌高水平促炎細(xì)胞因子，這些淋巴細(xì)胞和炎癥介質(zhì)在肝臟炎癥損傷過程中起重要作用[3]。α-半乳糖神經(jīng)酰胺（α-GalCer）為不變型Vα14自然殺傷T細(xì)胞（NKT細(xì)胞）的特異性配體，可誘導(dǎo)免疫介導(dǎo)的肝損傷小鼠模型，模型小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶水平升高，肝小葉內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞變性壞死，其特點(diǎn)與人類AIH極為相似。研究[4]發(fā)現(xiàn)予C57BL/6小鼠注射α-GalCer可誘導(dǎo)明顯的細(xì)胞因子反應(yīng)，包括腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、干擾素-γ（IFN-γ）、白細(xì)胞介素-2（IL-2）、IL-4、IL-6 等。

肝臟X受體（LXR）屬于核受體超家族成員，對(duì)脂類代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控起關(guān)鍵作用。近年研究發(fā)現(xiàn)LXR還具有調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和抗炎效應(yīng)。在接觸性皮炎、動(dòng)脈粥樣硬化、自身免疫性腦脊髓炎小鼠模型中，LXR激動(dòng)劑可有效抗炎、抑制炎癥基因表達(dá)，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[5 ～ 7]。本研究通過觀察LXR激動(dòng)劑對(duì)α-GalCer誘導(dǎo)的小鼠肝損傷的影響，探討LXR激活對(duì)肝損傷的保護(hù)作用及其可能機(jī)制，為進(jìn)一步了解AIH的發(fā)病機(jī)制、探索AIH的潛在治療靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑

雄性清潔級(jí)C57BL/6J小鼠15只，6 ～ 8周齡，體質(zhì)量18 ～ 22 g，由中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)中心。標(biāo)準(zhǔn)商業(yè)飼料購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。

LXR激動(dòng)劑T0901317（Cayman Chemical Company），α-GalCer Analog 7（AXXORA?Platform），即用型免疫組化超敏UltraSensitiveTMSP試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司），羊抗鼠IL-6多克隆抗體（Santa Cruz Biotechnology,Inc.），蛋白抽提試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所），小鼠 Akt、p-Akt、IκBα、p-IκBα、PI3K （p85）、NF-κB （p65）抗 體 （Cell Signaling Technology,Inc.），TRIzol?試劑（InvitrogenTMby Life Technologies），PrimeScriptTMRT reagent Kit（Perfect Real Time）、SYBR?Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）（TaKaRa Bio Inc.）。

二、方法

1.動(dòng)物分組和模型制備：小鼠隨機(jī)分為3組，分別為正常對(duì)照組、α-GalCer模型組和LXR治療組，每組5只。

T0901317預(yù)先溶于DMSO，濃度為50 mg/ml，－20℃保存，使用前以0.9%NaCl溶液稀釋至3 mg/ml[8]。 α-GalCer預(yù)先溶于 DMSO，濃度為 1 mg/ml，－20℃保存，使用前以含0.5%Tween-20的1×PBS稀釋至6μg/ml[9]。LXR治療組每天腹腔注射T0901317（30 mg/kg），注射體積為 0.3 ml，另兩組注射等體積溶劑，連續(xù)注射 7 d；第 8 d，α-GalCer模型組和LXR治療組腹腔注射α-GalCer（40μg/kg），注射體積為0.2 ml，正常對(duì)照組注射等體積溶劑。α-GalCer腹腔注射6 h后眼眶取血0.8 ～ 1.0 ml，處死小鼠，于肝臟右葉相同部位留取肝組織，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.肝臟組織病理學(xué)檢查：肝組織4%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

3.血清轉(zhuǎn)氨酶水平檢測：以HITACHI 7080全自動(dòng)生化分析儀檢測血清ALT、AST水平。

4.免疫組化染色檢測IL-6表達(dá)：甲醛固定石蠟包埋肝組織4μm厚連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，微波抗原修復(fù)，封閉液室溫封閉，滴加IL-6抗體（1:100），4℃過夜，滴加二抗，DAB顯色，自來水充分沖洗，蘇木精復(fù)染，封片。拍照后以Image-Pro Plus 6.0軟件分析肝組織IL-6陽性物質(zhì)單位面積內(nèi)的積分光密度值（IOD），作為IL-6蛋白相對(duì)表達(dá)量。

5.蛋白質(zhì)印跡法檢測PI3K/Akt/NF-κB信號(hào)通路激活情況：抽提肝組織總蛋白，測定蛋白濃度。電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，依次一抗、二抗孵育，ECL顯影，定影。掃描圖像，ImageJ 1.42軟件分析肝組織各目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

6.實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測TNF-α、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA表達(dá)：抽提肝組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以之為模板行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，引物設(shè)計(jì)采用Primer Express軟件（見表 1）。PCR 循環(huán)參數(shù)：95 ℃ 10 s；95 ℃ 10 s，60 ℃20 s，81 ℃ 1 s，45 個(gè)循環(huán)。以 β-actin 為內(nèi)參照，2－△△Ct法計(jì)算目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。以正常對(duì)照組表達(dá)量為基數(shù)，將α-GalCer模型組和LXR治療組的表達(dá)量轉(zhuǎn)換成與正常對(duì)照組的比值表示。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、LXR激活減輕α-GalCer誘導(dǎo)的肝損傷

正常對(duì)照組肝組織結(jié)構(gòu)正常，未見明顯淋巴細(xì)胞浸潤和肝細(xì)胞壞死；α-GalCer模型組肝組織門管區(qū)和小葉內(nèi)大量淋巴細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞腫脹壞死明顯；LXR治療組肝組織淋巴細(xì)胞浸潤程度明顯輕于α-GalCer模型組，偶見肝細(xì)胞壞死（見圖1）。各組血清ALT、AST水平的變化與肝組織病理學(xué)改變平行，α-GalCer模型組顯著高于正常對(duì)照組，LXR治療組則較α-GalCer模型組顯著降低（見表2）。

表2 各組血清轉(zhuǎn)氨酶水平比較（x±s,U/L）

二、LXR激活下調(diào)肝組織IL-6表達(dá)

免疫組化染色顯示，IL-6陽性物質(zhì)呈棕黃色，主要定位于細(xì)胞質(zhì)。α-GalCer模型組IL-6主要表達(dá)于肝細(xì)胞中，肝組織IL-6表達(dá)量較正常對(duì)照組顯著上調(diào)（6512.23±356.74 對(duì) 98.17±38.59,P<0.01），LXR 治療組（501.46±79.84）則較 α-GalCer模型組顯著下調(diào)（P<0.01）（見圖 2）。

三、LXR激活抑制肝內(nèi)PI3K/Akt/NF-κB信號(hào)通路

蛋白質(zhì)印跡法檢測顯示，各組間肝組織總Akt、 總 IκBα 蛋白表達(dá)量無明顯差異，α-GalCer模型組 PI3K p85、p-Akt、p-IκBα、NF-κB p65 蛋 白表達(dá)量較正常對(duì)照組顯著上調(diào)，LXR治療組則較α-GalCer模型組顯著下調(diào)（見表3、圖3）。

四、LXR激活下調(diào)肝組織TNF-α、iNOSmRNA表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測顯示，α-GalCer模型組肝組織TNF-α、iNOSmRNA表達(dá)量較正常對(duì)照組明顯上調(diào)，LXR治療組則較α-GalCer模型組顯著下調(diào)（TNF-α:2.19±1.34 對(duì) 7.31±3.78,P<0.05;iNOS:2.65±1.21 對(duì) 5.12±0.67,P<0.05）。

表3 各組肝內(nèi)PI3K/Akt/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)量比較（±s ）

表3 各組肝內(nèi)PI3K/Akt/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)量比較（±s ）

*與正常對(duì)照組比較，P<0.01；與 α-GalCer模型組比較，△P<0.05，▲P<0.01

組 別 例數(shù) PI3K p85 p-Akt 總Akt p-IκBα 總IκBα NF-κB p65正常對(duì)照組 5 0.30±0.02 0.26±0.03 1.00±0.07 0.11±0.01 0.76±0.02 0.37±0.02 α-GalCer模型組 5 0.86±0.01* 0.67±0.05* 1.08±0.07 1.08±0.02* 0.80±0.01 0.89±0.01*LXR 治療組 5 0.75±0.02△ 0.46±0.02▲ 0.99±0.08 0.83±0.01▲ 0.81±0.01 0.72±0.07△

圖3 各組肝內(nèi)PI3K/Akt/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白蛋白質(zhì)印跡法電泳圖

討 論

AIH的病因和發(fā)病機(jī)制至今尚未明確。AIH患者肝臟具有典型的界面性肝炎特征，門管區(qū)有大量淋巴細(xì)胞浸潤，并有較高水平的促炎細(xì)胞因子分泌，表明肝內(nèi)免疫反應(yīng)引起的炎癥可能在AIH的發(fā)生、發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用[10]。因此，通過免疫調(diào)節(jié)抑制肝臟炎癥成為治療AIH的重要途徑之一。

理想的動(dòng)物模型對(duì)AIH的研究具有重要意義。伴刀豆球蛋白A（Con A）模型和α-GalCer模型均為經(jīng)典的免疫介導(dǎo)肝損傷小鼠模型。然而，Con A模型的肝臟炎癥并非由自身抗原所誘導(dǎo)，α-GalCer則可作為天然自身抗原的替代抗原被MHC-Ⅰ樣分子CD1d呈遞至NKT細(xì)胞[4]。因此α-GalCer模型與Con A模型相比更接近人類自身免疫性肝病，是研究AIH理想的動(dòng)物模型。

LXR系于1994年從肝cDNA文庫克隆得到，因在肝臟內(nèi)大量表達(dá)而得名，包括LXRα（NR1H3）和LXRβ（NR1H2）兩種亞型。LXRα和LXRβ在組織分布上有一定差異，LXRα在肝臟內(nèi)高表達(dá)，在腎上腺、腸、脂肪組織、巨噬細(xì)胞、肺、腎等部位亦有一定水平的表達(dá)，LXRβ則在全身廣泛表達(dá)。除參與調(diào)控膽固醇的吸收、輸出、轉(zhuǎn)運(yùn)、分泌等過程，LXR對(duì)免疫和炎癥反應(yīng)亦具有調(diào)節(jié)作用[11]。研究發(fā)現(xiàn)LXR 激活可抑制 Toll樣受體 4（TLR4）、IL-1β、TNF-α等介導(dǎo)的信號(hào)通路及其下游炎癥基因表達(dá)，可由LXR激動(dòng)劑抑制的參與免疫反應(yīng)的炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子、趨化因子等基因包括iNOS、環(huán)氧合酶-2（COX-2）、IL-6、IL-1β、粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）、MCP-3、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-1β（MIP-1β）、干擾素誘導(dǎo)蛋白-10（IP-10）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）等[6]。T0901317是人工合成的LXR選擇性激動(dòng)劑，可以同時(shí)激活LXRα和LXRβ。LXR激動(dòng)劑已在多個(gè)自身免疫性疾病，如實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎、膠原性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型中被證實(shí)可減輕癥狀、改善炎癥[12,13]，然而關(guān)于LXR激活對(duì)肝臟自身免疫性炎癥性疾病的保護(hù)作用及其機(jī)制的研究尚少。本研究首次在α-GalCer誘導(dǎo)的小鼠肝損傷模型中證實(shí)LXR激活可調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，抑制肝臟炎癥，從而發(fā)揮肝臟保護(hù)作用。

血清轉(zhuǎn)氨酶活性升高是AIH重要的臨床生化指標(biāo)，在一定程度上可反映肝損傷的嚴(yán)重程度[14]。本研究發(fā)現(xiàn)LXR激活能顯著降低腹腔注射α-GalCer引起的血清ALT、AST水平升高，組織病理學(xué)檢查示α-GalCer模型組小鼠肝內(nèi)大量淋巴細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞腫脹壞死明顯，而LXR治療組小鼠的淋巴細(xì)胞浸潤程度明顯輕于α-GalCer模型組，僅偶見肝細(xì)胞壞死，證實(shí)肝損傷程度與血清轉(zhuǎn)氨酶水平的變化相一致。

IL-6為Th17型細(xì)胞因子，在肝臟中可由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肝細(xì)胞等產(chǎn)生，是一種促炎細(xì)胞因子。研究[15]顯示AIH患者血清IL-6水平顯著升高，并與肝臟炎癥相關(guān)。Th17細(xì)胞可誘導(dǎo)肝細(xì)胞表達(dá)IL-6，而IL-6進(jìn)一步作用于Th17細(xì)胞，形成正反饋，這可能是AIH的發(fā)病機(jī)制之一。本研究中小鼠腹腔注射α-GalCer后肝細(xì)胞IL-6表達(dá)顯著上調(diào)，而LXR激活可顯著下調(diào)α-GalCer引起的肝細(xì)胞IL-6分泌，從而調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，抑制肝臟炎癥。

研究表明PI3K/Akt信號(hào)通路可負(fù)反饋調(diào)節(jié)過度的先天免疫和TLR介導(dǎo)的促炎反應(yīng)[16]，可能與自身免疫性疾病有關(guān)[17]，但該信號(hào)通路與AIH之間有無聯(lián)系尚無相關(guān)報(bào)道。PI3K/Akt信號(hào)通路激活可誘導(dǎo)IκBα磷酸化，使 NF-κB p65亞基與之解離并向核內(nèi)易位，從而激活NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性，啟動(dòng)一系列免疫、炎癥反應(yīng)相關(guān)細(xì)胞因子基因表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)α-GalCer腹腔注射可激活肝內(nèi)PI3K/Akt信號(hào)通路，肝組織PI3K、p-Akt表達(dá)明顯上調(diào)，p-IκBα、NF-κB p65 同時(shí)上調(diào)，而 LXR 激活可顯著下調(diào)α-GalCer引起的上述蛋白表達(dá)上調(diào)，提示LXR激活可抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的激活，通過抑制IκBα磷酸化而影響NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性，從而減少促炎細(xì)胞因子表達(dá)，抑制肝臟炎癥，起到保護(hù)肝臟的作用。

TNF-α是介導(dǎo)α-GalCer誘導(dǎo)的肝損傷的重要介質(zhì)，以抗體中和TNF-α可顯著減輕α-GalCer誘導(dǎo)的肝損傷[4]。TNF-α可通過NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)iNOSmRNA和蛋白表達(dá)[18]，而iNOS催化產(chǎn)生的一氧化氮（NO）可介導(dǎo)肝損傷。本研究證實(shí)LXR激活可顯著下調(diào)α-GalCer腹腔注射引起的肝組織TNF-α、iNOSmRNA表達(dá)上調(diào)，從而減輕肝損傷。

綜上所述，以LXR激動(dòng)劑T0901317激活LXR可調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，抑制肝臟炎癥，從而顯著減輕α-GalCer誘導(dǎo)的小鼠肝損傷，提示LXR激動(dòng)劑對(duì)AIH具有潛在治療價(jià)值。LXR激活對(duì)肝臟的保護(hù)機(jī)制可能與抑制PI3K/Akt/NF-κB信號(hào)通路激活有關(guān)。

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