王園園 劉 炯 李金輝 蕭樹東鄭 青# 汪 錚#

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院消化內(nèi)科 上海市消化疾病研究所1（200001）南京軍區(qū)南京總醫(yī)院消化內(nèi)科2

細小病毒H-1是自主性細小病毒的主要代表之一，對腫瘤細胞和惡性轉(zhuǎn)化細胞有選擇性殺傷作用，而對正常細胞無影響[1]，有望成為新型的抗腫瘤制劑。多項實驗已證實非結(jié)構(gòu)蛋白NS1是細小病毒H-1發(fā)揮細胞毒作用的效應(yīng)蛋白[1～3]。本課題前期研究[4]結(jié)果顯示，低分化胃癌細胞對細小病毒H-1的細胞毒作用較為敏感，可能與細胞中NS1蛋白的產(chǎn)生和集聚能力增高有關(guān)。本研究利用成功構(gòu)建的細小病毒H-1非結(jié)構(gòu)蛋白NS1基因重組真核質(zhì)粒為載體，旨在深入研究NS1基因?qū)Ω叻只赴┘毎闙KN28、中分化胃癌細胞株SGC7901和低分化胃癌細胞株MKN45的影響，從而為進一步探討NS1基因的抗腫瘤效應(yīng)以及研究相關(guān)機制奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

一、質(zhì)粒、細胞株和主要試劑

細小病毒H-1儲存液由海德堡大學(xué)德國癌癥研究中心（DKFZ）Rommelaere教授惠贈，細小病毒H-1非結(jié)構(gòu)蛋白NS1基因真核表達質(zhì)粒 pcDNA3.1-NS1由劉炯博士成功構(gòu)建；真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1由金思特科技（南京）有限公司提供。不同分化程度的人胃癌細胞株 MKN28、SGC7901、MKN45由上海市消化疾病研究所凍存。質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，限制性內(nèi)切酶、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒購自寶生物工程 （大連）有限公司，Unizol試劑（上海博星基因芯片有限責任公司），G418（Gibco，InvitrogenTMby Life Technologies），脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000（InvitrogenTMby Life Technologies），小鼠抗人 CD44單克隆抗體（BD 公司）。

二、方法

1.質(zhì)粒抽提：分別將pcDNA3.1空質(zhì)粒菌液和pcDNA3.1-NS1質(zhì)粒菌液涂于氨芐西林（Amp）抗性的LB培養(yǎng)板，倒置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)過夜培養(yǎng)。挑選一單克隆菌落加入5 ml LB培養(yǎng)基，37℃搖床220 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。按試劑盒說明書抽提菌液中的質(zhì)粒。

2.質(zhì)粒的雙酶切鑒定：對抽提得到的pcDNA3.1空質(zhì)粒和重組質(zhì)粒pcDNA3.1-NS1進行雙酶切鑒定， 反應(yīng)體系內(nèi)含 KpnⅠ1 μl、XhoⅠ1 μl、10×M 緩沖液 2 μl、質(zhì)粒 DNA 5 μl，加 ddH2O 補足至 20 μl，37℃酶切2 h。行1%瓊脂糖凝膠電泳。

3.重組質(zhì)粒的測序鑒定：取5 μl經(jīng)雙酶切鑒定的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-NS1，送上海英駿生物技術(shù)有限公司，以NCBI/BLAST分析測序結(jié)果。

4.G418最佳篩選濃度確定：將MKN28、SGC7901、MKN45細胞按 105/孔分別接種于24孔板，并設(shè)置對照組（未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒）、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和重組質(zhì)粒pcDNA3.1-NS1轉(zhuǎn)染組，分別于100、200、300、400、500、600、700 μg/ml G418 濃度下進行篩選，選擇在10～14 d內(nèi)使對照組細胞全部死亡的最低G418濃度行下一步篩選試驗。

5.質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染胃癌細胞：參照LipofectamineTM2000試劑說明書，將質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染胃癌MKN28、SGC7901、MKN45細胞，48 h后加入G418，于篩選濃度下（300 μg/ml）繼續(xù)培養(yǎng)4周，挑出單克隆細胞株擴大培養(yǎng)。

6.RT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染細胞中NS1基因表達：Unizol試劑抽提 MKN28、SGC7901、MKN45 轉(zhuǎn)染細胞總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，NS1上游引物：5’-TCC ACA GCC TGC CAA GGT-3’， 下游：5’-CTC AAA TCC GCC TCG ATC TC-3’，片段長度87 bp。PCR反應(yīng)體系內(nèi)含模板 cDNA 2 μl、NS1 上下游引物混合液（10 μmol/L）2 μl、Premix Ex Taq 12.5 μl，以 ddH2O 補足至 25 μl。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃1 min，30個循環(huán)；72℃ 10 min。行1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定NS1表達。

7.裸鼠體內(nèi)成瘤實驗：4周齡雌性BALB/c裸鼠（中國科學(xué)院上海實驗動物中心）30只，分為6組，每組5只，22℃無菌條件下飼養(yǎng)。MKN28、SGC7901、MKN45細胞分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空質(zhì)粒和重組質(zhì)粒pcDNA3.1-NS1后，以106/300 μl細胞懸液濃度皮下接種至裸鼠右側(cè)背部，觀察成瘤情況。3周后，將裸鼠處死，取出瘤體，測量瘤體長徑（a）、短徑（b），瘤體體積=ab2/2。同時瘤體行病理切片分析。

8.胃癌細胞CD44表達的檢測：胃癌MKN28、SGC7901、MKN45細胞分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空質(zhì)粒和重組質(zhì)粒pcDNA3.1-NS1后，用無酶細胞分離液消化，PBS洗滌2次，制成單細胞懸液。每種細胞均設(shè)置陰性對照管和CD44標記管，每管200 μl懸液，加入小鼠抗人CD44-APC振蕩混勻，細胞與熒光素共軛抗體在室溫下避光孵化15 min。流式細胞儀計數(shù)5000～10 000個細胞，采用Cell-Quest軟件分析。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、雙酶切鑒定結(jié)果

pcDNA3.1空質(zhì)粒僅擴增出一條5000 bp以上的條帶，而重組質(zhì)粒pcDNA3.1-NS1經(jīng)KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切后可見2條條帶，其中一條在5000 bp以上，與pcDNA3.1空質(zhì)粒大小一致，另一條大小約2000 bp，與 NS1 片段長度（2019 bp）吻合（見圖 1）。

二、重組質(zhì)粒的測序鑒定

重組質(zhì)粒pcDNA3.1-NS1的測序結(jié)果經(jīng)NCBI/BLAST分析，其mRNA序列與已知序列完全吻合。

三、NS1基因表達

胃癌 MKN28、SGC7901、MKN45細胞轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1-NS1后，均擴增出大小為87 bp的NS1條帶，而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的細胞均未擴增出任何條帶（見圖 2）。

四、裸鼠體內(nèi)成瘤實驗

轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒和重組質(zhì)粒pcDNA3.1-NS1的MKN28細胞皮下接種2周時，分別有5只和4只裸鼠長出瘤體，平均體積分別為（461.04±18.09）mm3和（457.40±20.11） mm3，組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。接種10 d左右，SGC7901和MKN45細胞空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組裸鼠即可觀察到瘤體；而接種轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1-NS1的SGC7901和MKN45細胞后，直至處死所有裸鼠均未觀察到腫瘤生長。

接種后3周，各胃癌細胞HE染色示細胞核增大，核深染、核分裂象增多，為腫瘤細胞特征（見圖 3）。

五、CD44表達

轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空質(zhì)粒后，MKN28細胞不表達CD44，SGC7901和MKN45細胞中CD44表達量分別為97.6%和92.6%；轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1-NS1后，MKN28細胞亦不表達 CD44，SGC7901和MKN45細胞中CD44表達量明顯降低，分別為44.0%和41.2%（見圖 4）。

討 論

我國胃癌發(fā)病率在各種消化道惡性腫瘤中位居前列，嚴重危害人們的健康。在傳統(tǒng)放化療對胃癌療效不佳的情況下，積極探索低毒的有效靶向根除腫瘤的抗原是腫瘤基礎(chǔ)研究的方向。細小病毒H-1對腫瘤細胞和轉(zhuǎn)化細胞具有選擇性殺傷和抑制生長的作用，具有親瘤性和溶瘤性[5,6]。Ran等[4]和Liu等[7]前期觀察發(fā)現(xiàn)不同胃癌細胞對細小病毒H-1細胞毒作用的敏感性存在差異，并對其可能機制進行了初步探討。Cornelis等[8]的研究表明，細小病毒的腫瘤抑制作用不僅可通過其在腫瘤細胞中的大量復(fù)制而實現(xiàn)，還可通過產(chǎn)生毒性NS1蛋白來發(fā)揮效應(yīng)。NS1是一種多功能蛋白，具有解旋酶、核酸內(nèi)切酶、ATP酶、DNA-nicking和序列特異性DNA結(jié)合活性，既可控制病毒DNA的復(fù)制和表達，還具有細胞毒性作用，與病毒抗腫瘤活性直接相關(guān)[9]。NS1的毒性效應(yīng)與細胞蛋白的磷酸化有關(guān)[10～12]，新近研究表明NS1蛋白通過連接細胞內(nèi)酪蛋白激酶（CK）Ⅱα與原肌球蛋白而調(diào)節(jié)激酶的底物特異性，從而參與介導(dǎo)CKⅡ依賴的細胞骨架的改變和細胞死亡[11,12]。

本研究選取3種不同分化程度的胃癌細胞株，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1-NS1和空質(zhì)粒后皮下注射裸鼠，結(jié)果顯示高分化胃癌MKN28細胞組裸鼠均可見腫瘤生長，且兩組腫瘤大小無明顯差異；中分化胃癌SGC7901和低分化胃癌MKN45細胞空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組裸鼠亦可觀察到腫瘤生長，而轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1-NS1后均未見腫瘤生長，證實NS1基因?qū)χ械头只奈赴┘毎L具有抑制作用。與Ran等[4]的低分化胃癌細胞株對細小病毒H-1細胞毒作用較為敏感的研究結(jié)果相一致。此外，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的SGC7901和MKN45細胞表面覆蓋了一層溶胞樣的膜狀物，而MKN28細胞未見此現(xiàn)象。

腫瘤干細胞的研究近年成為腫瘤研究的熱點之一，可通過識別出這一小部分細胞從而進行靶向治療以徹底殺滅殘存的腫瘤細胞，阻止其轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。目前已報道了數(shù)種腫瘤干細胞的表面標記物，但關(guān)于胃癌干細胞表面標記物的文獻報道極少。Takaishi等[13]的研究發(fā)現(xiàn)胃癌細胞株MKN45、MKN74和NCI-N87中，細胞表面標記CD44+的胃癌細胞具有自我更新、自分化等干細胞特性，體外無血清培養(yǎng)條件下可形成腫瘤球、在動物體內(nèi)具有致瘤性，且對化療和放療的耐受性更強，敲除CD44則導(dǎo)致腫瘤球形成能力和致瘤性明顯減弱。提示CD44+細胞具有胃癌干細胞特性，CD44與胃癌干細胞具有較強的相關(guān)性，可能是胃癌干細胞的表面標記之一。本實驗發(fā)現(xiàn)，SGC7901和MKN45細胞轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1-NS1后CD44含量明顯降低，而MKN28細胞轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒和重組質(zhì)粒pcDNA3.1-NS1后均無CD44表達。提示NS1對胃癌干細胞潛在標記物CD44具有抑制作用，NS1對分化程度不同的胃癌細胞株的敏感性差異可能與其對CD44的抑制作用有關(guān)，但具體機制還有待于深入研究。

綜上所述，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細小病毒H-1非結(jié)構(gòu)蛋白NS1基因后，胃癌細胞SGC7901和MKN45的致瘤能力受到抑制，并對胃癌干細胞潛在標記物CD44有明顯抑制作用，說明細小病毒H-1非結(jié)構(gòu)蛋白NS1基因表達對中低分化的胃癌細胞有較好的抗腫瘤活性，可能與其降低胃癌干細胞表型CD44的表達有關(guān)，有望成為胃癌治療的新型生物制劑。但目前關(guān)于非結(jié)構(gòu)蛋白NS1抑瘤效應(yīng)的分子調(diào)控機制尚未完全闡明，胃癌干細胞特異性表面標記物亦需進一步明確，這將是今后研究的方向。

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