蔣受軍，劉濤，朱斌#，韋濤，黃橘，劉常凱（.廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗所，南寧市5300；.桂林醫(yī)學院，桂林市 54004）

克霉唑具廣譜抗真菌活性，對表皮癬菌、毛發(fā)癬菌、曲菌、著色真菌、隱球菌屬和念珠菌屬均有顯著抑制作用?？嗣惯蛉楦酁槠つw科及婦科用藥類非處方藥，用于體癬、股癬、手癬、足癬、花斑癬、頭癬以及念珠菌性甲溝炎和念珠菌性外陰陰道炎，為外用制劑，是2005年版《中國藥典》二部收載品種[1]?？嗣惯驅φ婢幸种谱饔?，對這類具有抗菌活性的藥品進行微生物限度檢查時，應首先消除其抗菌活性，并通過試驗驗證抗菌活性的去除是否徹底，以保證檢驗結果的有效性?！吨袊幍洹房嗣惯蛉楦鄻藴收闹形词蛰d微生物限度檢查方法，現(xiàn)按照2005年版《中國藥典》二部附錄ⅪJ微生物限度檢查法有關規(guī)定[1]，對克霉唑乳膏的微生物限度檢查方法進行研究驗證，并用建立的方法對全國各企業(yè)生產的克霉唑乳膏進行微生物限度考察，以對國內克霉唑乳膏產品的微生物污染狀況進行分析評價。結果，所建立方法適用性好；國產克霉唑乳膏衛(wèi)生狀況良好。

1 儀器與材料

1.1 儀器

D-53電熱恒溫培養(yǎng)箱（德國Binder公司）；HHB11.600電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械廠）；HR1自動菌落計數(shù)儀（杭州訊數(shù)科技有限公司）；OLY生物顯微鏡（日本Olympus公司）；SG8酸度計（瑞士Mettler Toledo公司）；MLS-3780滅菌鍋（日本Sanyo公司）；無菌檢查薄膜過濾器（浙江寧海白石藥檢儀器廠）；生物安全柜（新加坡Esco公司）。

1.2 培養(yǎng)基和試劑

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、0.7%蛋白胨水、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基、溴代十六烷三甲銨瓊脂培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基均為北京三藥科技開發(fā)公司產品。

1.3 菌種

大腸埃希菌[CMCC（B）44 102]、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63 501]、白色念珠菌[CMCC（F）98 001]、黑曲霉[CMCC（F）98 003]均由中國醫(yī)學微生物菌種保藏管理中心提供。

1.4 藥品

克霉唑乳膏：來源于廣東順峰藥業(yè)有限公司、浙江盛基藥業(yè)有限公司、天津藥業(yè)集團新鄭股份有限公司、蕪湖三益制藥有限公司、廣州白云山制藥股份有限公司白云山何濟公制藥廠（以下簡稱何濟公制藥廠）等國內生產企業(yè)共276批樣品，規(guī)格有1%、3%2種，具體情況詳見表1（批號略）。

表1 樣品來源、規(guī)格及批次Tab 1 Source，specification and batch number of samples

2 方法與結果

參照2005年版《中國藥典》微生物限度檢查法試驗[1]。

2.1 菌液的制備

接種金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸埃希菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24 h；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，23～28℃培養(yǎng)24～48 h。上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 mL含菌數(shù)為50～100 cfu的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中，23～28℃培養(yǎng)5～7 d，加入3～5 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫；吸出孢子懸液至無菌試管內，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 mL含孢子數(shù)為50～100 cfu的孢子懸液。

2.2 供試液的制備

取樣品10 g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液70 mL，混勻，加30 mL無菌吐溫-80，混勻，加入30 mL十四烷酸異丙酯萃取，取下層作為1∶10的供試液。

2.3 細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)檢查方法的建立及驗證

2.3.1 計數(shù)檢查方法。①培養(yǎng)基稀釋法：取不同量供試液（1∶10）注皿，每皿分別加入1 mL驗證菌菌液，注入15～20 mL不超過45℃的溶化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，搖勻，凝固，培養(yǎng)。如每皿注入0.5 mL，則為1∶20稀釋。

②薄膜過濾法：取1∶10供試液1 mL，加入100 mL pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，采用薄膜過濾法處理，0.9%無菌氯化鈉溶液300 mL沖洗（每膜）。

2.3.2 敏感菌株及方法篩選。選取1批克霉唑乳膏按培養(yǎng)基稀釋法進行試驗，進行驗證敏感菌株初步篩選。培養(yǎng)基稀釋法（每皿0.5 mL）、薄膜過濾法加菌回收率試驗結果見表2。

表2 2種方法回收率試驗結果Tab 2 Results of 2 kinds of recovery tests

采用培養(yǎng)基稀釋法（每皿0.5 mL），結果3株細菌驗證菌回收率均達到要求（大于70%）；白色念珠菌回收率為0，黑曲霉大于70%。由此表明：①克霉唑對白色念珠菌有很強的抑制作用，為5種驗證菌中對克霉唑最敏感菌株，方法篩選可采用該菌株進行；②培養(yǎng)基稀釋法即可消除克霉唑對細菌的抑制作用，初步確定細菌計數(shù)可采用培養(yǎng)基稀釋法（每皿0.5 mL）；③以白色念珠菌為試驗菌，對薄膜過濾法進行初步驗證，結果回收率為97%，表明薄膜過濾法可消除克霉唑對白色念珠菌的抑制作用，初步確定霉菌和酵母菌計數(shù)可采用薄膜過濾法進行。

2.3.3 方法驗證。以金黃色葡萄球菌、白色念珠菌為驗證菌，選取國內13家生產企業(yè)的各1批克霉唑乳膏為樣品，對初步確定的細菌、霉菌和酵母菌計數(shù)測定方法進行驗證，結果見表3。

表3 13家生產企業(yè)產品計數(shù)方法驗證結果Tab 3 Validation result of determination method for products from 13 manufacturers

表3結果表明，13個不同廠家樣品，細菌代表菌株金黃色葡萄球菌采用培養(yǎng)基稀釋法（每皿0.5 mL），回收率均大于70%；霉菌和酵母菌代表菌株白色念珠菌采用薄膜過濾法，回收率均大于70%。因此，克霉唑乳膏細菌計數(shù)方法采用培養(yǎng)基稀釋法（每皿0.5 mL），霉菌和酵母菌計數(shù)方法采用薄膜過濾法（沖洗量每膜300 mL）可滿足要求。

2.4 控制菌檢查方法的建立及驗證

（1）常規(guī)法：分別取1∶10的供試液10 mL，加入100 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，分別加入金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌10～100 cfu，35℃培養(yǎng)24～48 h。取培養(yǎng)物劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基平板，35℃培養(yǎng)24～48 h，觀察其菌落形態(tài)。

（2）培養(yǎng)基稀釋法：培養(yǎng)基用量為300 mL，其他同常規(guī)法。

另取大腸埃希菌作為陰性對照試驗菌?？刂凭炞C試驗結果見表4（表中“/”表示未做）。

表4 控制菌驗證試驗結果Tab 4 Validation result of determination method for pathogenic bacteria

表4結果表明，采用常規(guī)法（培養(yǎng)基用量100 mL）進行銅綠假單胞菌檢查方法成立?？嗣惯蛉楦鄬瘘S色葡萄球菌有一定抑制作用，需采用培養(yǎng)基稀釋法（培養(yǎng)基用量300 mL）進行。

2.5 樣品微生物限度檢查

根據驗證結果，確定細菌計數(shù)采用培養(yǎng)基稀釋法（每皿0.5 mL），霉菌和酵母菌計數(shù)采用薄膜過濾法（沖洗量300 mL），金黃色葡萄球菌采用培養(yǎng)基稀釋法（培養(yǎng)基用量300 mL），銅綠假單胞菌采用常規(guī)法（培養(yǎng)基用量100 mL），對276批國產克霉唑乳膏進行微生物限度檢查，結果見表5。

表5 276批樣品微生物限度檢查結果Tab 5 Results of microbial limit test of 276 batches of samples

由表5可見，對276批克霉唑乳膏進行微生物限度檢查，結果合格率99.3%；有2批樣品不合格，均為細菌計數(shù)不合格。

3 討論

3.1 供試液處理

對于部分乳膏、栓劑等非水溶性供試品，需采用吐溫、十四烷酸異丙酯等進行乳化、萃取前處理，以分離乳膏基質和藥用成分，提取污染菌，供試液制備過程相對復雜[2，3]?？嗣惯蛉楦嗷|對供試品前處理影響較大，在制備供試液過程中，采用了吐溫-80作為表面活性劑、十四烷酸異丙酯對樣品進行萃取以分離基質和藥用成分、提取污染菌。由于各廠家處方、工藝的差異，不同廠家產品處理過程中，乳膏基質的除去難易不等，一些樣品較容易實現(xiàn)分離提取，一些樣品則需要加熱才能有效溶解萃??；在進行薄膜過濾時，一些樣品提取液仍堵塞濾膜，需減少每膜上樣量或進行多次提取。

3.2 標準的建立設想

經對不同廠家的克霉唑乳膏檢查方法進行驗證，表明細菌計數(shù)采用培養(yǎng)基稀釋法（每皿0.5 mL）、霉菌和酵母菌計數(shù)采用薄膜過濾法（沖洗量每膜300 mL）、控制菌金黃色葡萄球菌采用培養(yǎng)基稀釋法（培養(yǎng)基用量300 mL）、銅綠假單胞菌采用常規(guī)法（培養(yǎng)基用量300 mL）檢驗均能滿足2005年版《中國藥典》對微生物限度檢查方法的要求。由于克霉唑乳膏具有抗菌作用，其微生物限度檢驗方法如果不收入各論，則不同實驗室進行該品種均要對方法進行研究，易造成各實驗室檢驗方法的差異以及不必要的重復工作。此次研究所建立的方法經過國內各廠家產品的驗證，具有良好的通用性，建議考慮收入克霉唑乳膏標準正文。

3.3 克霉唑乳膏微生物限度檢查結果分析

3.3.1 整體情況。采用建立的微生物限度檢驗方法對抽驗的276批樣品進行檢驗，結果2批樣品不合格，均為細菌計數(shù)超過規(guī)定限度，不合格率為0.7%。

3.3.2 樣品的真菌污染。雖然克霉唑乳膏為抗真菌藥，但樣品檢驗結果顯示，部分樣品存在不同程度的真菌污染，其中一些樣品真菌污染較為嚴重，測定結果接近限度規(guī)定。樣品中檢出的真菌類型基本為霉菌，從形態(tài)上分析主要有青霉、根霉、毛霉等。提示雖然克霉唑具廣譜抗真菌活性，但也不可能殺滅所有真菌，對一些真菌沒有殺菌作用或者僅為暫時的抑制作用，如果生產過程各個環(huán)節(jié)不嚴格控制，都會造成產品的真菌污染?？嗣惯蛉楦酁橹委熣婢腥镜耐庥盟帲绻a品本身即存在較嚴重的真菌污染，給用藥者會帶來二次感染的風險。

3.3.3 樣品的細菌感染。部分克霉唑乳膏存在細菌污染，細菌數(shù)標準規(guī)定限度為不得超過1 000個/g[1]，而有2批不合格樣品細菌數(shù)分別為1 100 000、820 000個/g，嚴重超標。

對2批不合格樣品的檢出菌進行分離鑒定，結果顯示，2個樣品均為單一菌污染。分離得到的菌株分別采用涂片鏡檢、生化鑒定、分子生物學基因分型分析。結果，上述2批樣品污染菌均為洋蔥霍爾德菌。該菌為呼吸系統(tǒng)疾病的致病菌，感染性強、危害風險較大。2批不合格樣品為同一廠家產品，檢出菌鑒定顯示2批產品為相同微生物污染，提示該企業(yè)生產環(huán)節(jié)可能存在系統(tǒng)的污染來源。

3.3.4 嚴格控制微生物污染。由于克霉唑乳膏基質相對較適合微生物存活，且效期較長，在產品生產過程中帶入的微生物污染，在產品貯存、流通過程中，如果有適宜條件，一些特定微生物可能會大量繁殖，給用藥者帶來危害。因此，必須嚴格控制產品的微生物污染。

[1] 國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（二部）[S].2005年版.北京：化學工業(yè)出版社，2005：236、附錄93-98.

[2] 王 進.環(huán)吡酮胺陰道栓微生物限度檢查方法研究[J].中國藥房，2008，19（28）：2 216.

[3] 盧文斌，郭瑜蓉.硝酸咪康唑乳膏微生物限度檢查方法學驗證[J].海峽藥學，2009，21（9）：48.