李遼閩 曾慶莉

（1 湖北省襄陽(yáng)市婦幼保健院，湖北 襄陽(yáng) 441000；2 湖北省黃石市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)所，湖北 黃石 435000）

復(fù)方米諾地爾酊為淡黃色至棕褐色的澄清液體。主要成分為生姜、辣椒、米諾地爾等。對(duì)斑禿、脂溢性脫發(fā)、病后脫發(fā)、老年性脫發(fā)均有效。因其具有較強(qiáng)的抑菌作用，采用常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法難以除去其抑菌成分，我們采用薄膜過(guò)濾法[1]，按中國(guó)藥典2005年版二部相關(guān)規(guī)定[2]進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，該方法省時(shí)、易操作，適用于復(fù)方米諾地爾酊微生物限度檢查。

1 儀器、試藥和菌種

1.1 生物安全柜、隔水式恒溫培養(yǎng)箱（30～35℃）、生化培養(yǎng)箱（23～28℃）、電熱干燥箱（160～250℃）、立式滅菌器、電子天平、薄膜過(guò)濾器、集菌儀、超凈臺(tái)。

1.2 營(yíng)養(yǎng)瓊脂、改良馬丁氏液體培養(yǎng)基、改良馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基、溴化十六烷三甲胺瓊脂培養(yǎng)基，均由北京陸橋技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.3 稀釋劑：氯化鈉-蛋白胨緩沖液，由北京陸橋技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.4 菌種：大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；所有菌種均為第四代。

1.5 樣品：復(fù)方米諾地爾酊（批號(hào)：100305、100510、100916，100ml/瓶）襄陽(yáng)市婦幼保健院制劑室。

2 方法與結(jié)果

2.1 細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)測(cè)定方法驗(yàn)證試驗(yàn)

2.1.1 菌液的制備

接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)18～24h，各取1mL，分別加9mL的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，10倍稀釋至10-5～10-7，活菌數(shù)約為50～100cfu/mL，做活菌計(jì)數(shù)備用。

接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁氏液體培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)18～24h，取1mL，加9mL的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，10倍稀釋至10-5～10-7，活菌數(shù)約為50～100cfu/mL，做活菌計(jì)數(shù)備用。

接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁氏瓊脂斜面培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)一周，加5mL的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，洗下霉菌孢子，吸出菌液，用標(biāo)準(zhǔn)比濁管比濁。取1mL，加9mL的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，10倍稀釋至10-4，活菌數(shù)約為50～100cfu/mL，做活菌計(jì)數(shù)備用。

2.1.2 供試液的制備

吸取樣品10mL至有無(wú)菌玻璃珠的250mL三角燒瓶中，加90mL無(wú)菌的稀釋液，混勻，使成1∶10的供試液。取上述供試液10mL（相當(dāng)于樣品1g），加入100mL無(wú)菌稀釋液中，混勻，過(guò)濾，接著用400的稀釋劑沖洗，消除抑菌成分后，取出濾膜，菌面朝上，貼于規(guī)定的瓊脂平板上培養(yǎng)。

2.1.3 回收率測(cè)定

①試驗(yàn)組：分別取1∶10的供試液10mL（相當(dāng)于樣品1g），加入100mL無(wú)菌稀釋液中，混勻，過(guò)濾，接著用400mL的稀釋劑沖洗，預(yù)留100mL稀釋劑各加入大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌各1mL（50～100cfu/mL），按薄膜過(guò)濾法過(guò)濾，取出濾膜，菌面朝上，貼于規(guī)定的瓊脂平板上，置規(guī)定溫度培養(yǎng)24～72h，逐日觀察結(jié)果。②菌液組：除不加供試液外，其余操作同試驗(yàn)組。③供試品對(duì)照組：除不加菌懸液外，其余操作同試驗(yàn)組。④稀釋劑對(duì)照組：用稀釋劑取代供試液，其余操作同試驗(yàn)組。

2.1.4 結(jié)果

驗(yàn)證試驗(yàn)至少進(jìn)行三次獨(dú)立的平行試驗(yàn)，并分別計(jì)算各試驗(yàn)菌每次試驗(yàn)的回收率。（所得回收率均不低于70%）。

結(jié)論：采用薄膜過(guò)濾法檢驗(yàn)復(fù)方米諾地爾酊，該試驗(yàn)對(duì)5種菌種的回收率均高于70%，該驗(yàn)證試驗(yàn)通過(guò)。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 菌落計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證結(jié)果（cfu）

2.2 金黃色葡萄球菌檢查方法驗(yàn)證試驗(yàn)

2.2.1 試驗(yàn)組

取1∶10的供試液10mL（相當(dāng)于樣品1g），加入100mL無(wú)菌稀釋液中，混勻，過(guò)濾，接著用400mL的稀釋劑沖洗，預(yù)留100mL稀釋劑，加入金黃色葡萄球1mL（50～100cfu/mL），按薄膜過(guò)濾法過(guò)濾，取出濾膜，菌面朝上，貼于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基中35℃培養(yǎng)24h。

2.2.2 陰性菌對(duì)照組

取1∶10的供試液10mL（相當(dāng)于樣品1g），加入100mL無(wú)菌稀釋液中，混勻，過(guò)濾，接著用400mL的稀釋劑沖洗，預(yù)留100mL稀釋劑，加大腸埃希菌1mL（50～100cfu/mL），按薄膜過(guò)濾法過(guò)濾，取出濾膜，菌面朝上，貼于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基中35℃培養(yǎng)24h。

2.2.3 陽(yáng)性對(duì)照組

除不加供試液外，其余操作同試驗(yàn)組。

2.2.4 陰性對(duì)照組

用稀釋液取代供試液，不加菌液，其余操作同試驗(yàn)組。

結(jié)果：陰性菌對(duì)照組未檢出陰性對(duì)照菌；試驗(yàn)組檢出金黃色葡萄球；陽(yáng)性對(duì)照組檢出金黃色葡萄球；陰性對(duì)照組無(wú)菌生長(zhǎng)。結(jié)論：根據(jù)驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果，表明供試品可采用薄膜過(guò)濾法檢驗(yàn)金黃色葡萄球。

2.3 銅綠假單胞菌檢查方法驗(yàn)證試驗(yàn)

2.3.1 試驗(yàn)組

取1∶10的供試液10mL（相當(dāng)于樣品1g），加入100mL無(wú)菌稀釋液中，混勻，過(guò)濾，接著用400mL的稀釋劑沖洗，預(yù)留100mL稀釋劑，加銅綠假單胞菌1ml（50～100cfu/mL），按薄膜過(guò)濾法過(guò)濾，取出濾膜，菌面朝上，貼于溴化十六烷三甲胺瓊脂培養(yǎng)基中35℃培養(yǎng)24h。

2.3.2 陰性菌對(duì)照組

取1∶10的供試液10mL（相當(dāng)于樣品1g），加入100mL無(wú)菌稀釋液中，混勻，過(guò)濾，接著用400mL的稀釋劑沖洗，預(yù)留100mL稀釋劑，加大腸埃希菌1mL（50～100cfu/mL），按薄膜過(guò)濾法過(guò)濾，取出濾膜，菌面朝上，貼于溴化十六烷三甲胺瓊脂培養(yǎng)基中35℃培養(yǎng)24h。

2.3.3 陽(yáng)性對(duì)照組

除不加供試液外，其余操作同試驗(yàn)組。

2.3.4 陰性對(duì)照組

用稀釋液取代供試液，不加菌液，其余操作同試驗(yàn)組。

結(jié)果：陰性菌對(duì)照組未檢出陰性對(duì)照菌；試驗(yàn)組檢出銅綠假單胞菌；陽(yáng)性對(duì)照組檢出銅綠假單胞菌；陰性對(duì)照組無(wú)菌生長(zhǎng)。結(jié)論：根據(jù)驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果，表明供試品可采用薄膜過(guò)濾法檢驗(yàn)銅綠假單胞菌。

3 討 論

經(jīng)過(guò)試驗(yàn)觀察，說(shuō)明用薄膜過(guò)濾法處理過(guò)的供試液適合各種試驗(yàn)菌的生長(zhǎng)；供試品對(duì)照組無(wú)菌生長(zhǎng)說(shuō)明供試品中無(wú)影響試驗(yàn)的雜菌；菌液組各種菌生長(zhǎng)良好，說(shuō)明該方法的實(shí)驗(yàn)環(huán)境適合參加試驗(yàn)的各種菌的生長(zhǎng)；陰性對(duì)照組無(wú)菌生長(zhǎng)，說(shuō)明稀釋劑、培養(yǎng)基及試驗(yàn)操作過(guò)程符合無(wú)菌操作的標(biāo)準(zhǔn)。試驗(yàn)結(jié)果表明，采用薄膜過(guò)濾法能有效去除復(fù)方米諾地爾酊的抑菌成分，對(duì)試驗(yàn)菌的生長(zhǎng)無(wú)影響，該方法適合復(fù)方米諾地爾酊的微生物限度檢查。

[1] 馬緒榮,蘇德模.藥品微生物學(xué)檢驗(yàn)手冊(cè)[M].北京:科學(xué)出版社,2000:60.

[2] 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典.2005.二部[S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:附錄XI J.