陸麒羽，周裕洋，王俊波，王 琳，孟 璐，翁家侃，余 波，全 勝

(浙江大學(xué)城市學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，浙江杭州310015)

全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)是感染或非感染因素作用于機(jī)體而引起的一種全身性炎癥反應(yīng)綜合征。SIRS是常見的危重急癥之一，并易發(fā)展成多臟器功能障礙綜合征(Multiple organ dysfunction syndrome，MODS)甚至多臟器功能衰竭(Multiple Organ failure，MOF)，病死率高達(dá)70%左右［1］。由于引起SIRS病因十分復(fù)雜以及確切的發(fā)病機(jī)制仍未完全明了，也缺乏理想的動(dòng)物模型，因而對(duì)SIRS相關(guān)的實(shí)驗(yàn)往往無法得到良好的開展。

本實(shí)驗(yàn)通過酵母多糖-石蠟混懸液腹腔注射制作大鼠SIRS模型，力求制作與臨床SIRS表現(xiàn)一致，又排除感染因素等外源性干擾因素，符合SIRS診斷標(biāo)準(zhǔn)的動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 SD大鼠48只，5～7周齡，體重160～200 g，雌雄各半，由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，恒溫22℃室內(nèi)飼養(yǎng)，正常光照時(shí)間8:00 a.m.-20:00 p.m.，無飲食飲水限制。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作時(shí)間為8:00 a.m.-16:00 p.m.。將SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組和模型實(shí)驗(yàn)組，模型實(shí)驗(yàn)組按不同濃度分為500 mg/kg、750 mg/kg、1 000 mg/kg組，每組12 只。

1.2 主要試劑和設(shè)備 酵母多糖(zymosan A)由SIGMA公司(z4250)提供;液體石蠟購(gòu)自江西德成制藥有限公司;TNF-α ELISA定量檢測(cè)試劑盒由R＆D公司提供，IL-6，IL-10 ELISA定量檢測(cè)試劑盒由博士德生物有限公司提供。

1.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)前18 h，SD大鼠開始禁食(不禁水)，上午8時(shí)先稱重、測(cè)直腸溫度，將酵母多糖粉劑和液體石蠟混合，高頻振蕩15 min，然后在100℃水浴80 min滅菌，制成酵母多糖濃度為100 mg/ml的混懸液，用時(shí)以40℃水浴，高頻振蕩 15 min后以 500 mg/kg、750 mg/kg、1 000 mg/kg劑量分別對(duì)3組大鼠進(jìn)行腹腔注射。對(duì)照組注射滅菌生理鹽水。模型制作成功的標(biāo)志根據(jù)胡森提供的動(dòng)物SIRS的一般標(biāo)準(zhǔn):①直腸溫度較正?；騻吧呋蚪档?℃;②呼吸頻率超過正常對(duì)照組2倍或PaCO2較對(duì)照值降低25%;③白細(xì)胞總數(shù)超過對(duì)照值的2倍或減少50%;④心率較對(duì)照值增加50%;⑤主要臟器病理學(xué)改變;⑥相關(guān)細(xì)胞因子改變［9］。根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件以及數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性，本實(shí)驗(yàn)選擇①③⑤⑥四項(xiàng)指標(biāo)來觀察SIRS模型是否成功。

1.4 大鼠SIRS模型觀察指標(biāo)和方法 觀察24 h和48 h時(shí)各組大鼠的死亡率、一般情況、測(cè)量其直腸溫度和白細(xì)胞計(jì)數(shù)，而后分別取各組大鼠的肝、肺組織，肉眼觀察大體病變后，置于10%福爾馬林中浸泡固定24h。然后石蠟包埋，切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.5 WBC計(jì)數(shù) 采用自動(dòng)血細(xì)胞檢測(cè)儀結(jié)合顯微鏡下手工技術(shù)，檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組大鼠尾靜脈血標(biāo)本中的WBC總數(shù)。

1.6 細(xì)胞因子的檢測(cè) 取各組24 h尾靜脈血標(biāo)本，按 TNF-α、IL-6、IL-10 ELISA 定量檢測(cè)試劑盒提供的操作說明書，檢測(cè)標(biāo)本中TNF-α、IL-6、IL-10水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用SPSS 16.0軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組計(jì)量數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用方差分析(F檢驗(yàn))，及組間對(duì)照t檢驗(yàn)，P﹤0.05為差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠的一般情況 對(duì)照組大鼠未出現(xiàn)明顯的外觀及體征改變，實(shí)驗(yàn)組大鼠在注射酵母多糖2h后，出現(xiàn)悚毛、氣促、反應(yīng)遲鈍、蜷縮等現(xiàn)象，隨注射劑量的增加體征改變?cè)矫黠@，并隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而加重，重者出現(xiàn)紫紺、昏睡甚至死亡。

2.2 病死率 正常對(duì)照組與腹腔注射酵母多糖500 mg/kg組均無大鼠死亡，腹腔注射酵母多糖1 000 mg/kg組24 h死亡數(shù)增加不明顯，而48 h死亡數(shù)較前三組均有明顯增加，腹腔注射酵母多糖750 mg/kg組死亡數(shù)較前兩組增加不明顯。具體各組病死率如表1所示。

2.3 白細(xì)胞及體溫改變 與正常組相比，實(shí)驗(yàn)b組、c組、d組24 h及48 h的體溫與白細(xì)胞計(jì)數(shù)均降低，差異性非常顯著(P﹤0.01)，且降低的程度隨酵母多糖懸液濃度的增加而增加。具體數(shù)值見表2。

表1 各組大鼠死亡率Table 1 The mortality of rats in each group

表2 各組大鼠溫度及白細(xì)胞計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)(±s)Table 2 The temperatures and total WBC numbers of rats in each group(±s)

表2 各組大鼠溫度及白細(xì)胞計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)(±s)Table 2 The temperatures and total WBC numbers of rats in each group(±s)

48 h時(shí)c組大鼠有1只大鼠死亡，11只大鼠參與檢測(cè);24 h時(shí)d組有2只大鼠死亡，10只大鼠參與檢測(cè);48 h后剩余大鼠數(shù)小于10只，其結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;24 h時(shí)b、c、d各組和48小時(shí)b、c各組的體溫及白細(xì)胞計(jì)數(shù)與正常對(duì)照組(a)比較均為有顯著性差異，P＜0.01;24、48 h時(shí)c組與b組比較，體溫及白細(xì)胞計(jì)數(shù)均有明顯下降，*P＜0.05，#P＜0.01;24 h時(shí)d組與c組比較，體溫及白細(xì)胞計(jì)數(shù)又有明顯下降，﹠P＜0.01.

組 別24 h存活 體溫 白細(xì)胞/109·L -1 48 h存活 體溫 白細(xì)胞/109·L -1(a)正常對(duì)照組 12 38.29±0.26 12.26±0.48 12 38.22±0.38 13.30±0.61(b)酵母多糖懸液(500 mg/kg) 12 37.59±0.30 8.08±0.82 12 37.23±0.29 8.71±0.38(c)酵母多糖懸液(750 mg/kg) 12 36.93±0.28* 6.01±0.50# 11 36.52±0.29# 6.34±0.53#(d)酵母多糖懸液(1 000 mg/kg) 10 36.50±0.20﹠ 5.40±0.50﹠4--

2.4 重要臟器病理形態(tài)學(xué)改變

2.4.1 肺臟 正常對(duì)照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔清晰，肺泡隔無水腫、細(xì)胞浸潤(rùn)等改變;腹腔注射酵母多糖懸液各組大鼠均出現(xiàn)不同程度的肺泡腔內(nèi)充血、出血;氣管上皮纖毛脫落;肺泡間隔增寬，充血、水腫，血管擴(kuò)張，大量紅細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，部分肺泡腔塌陷。見圖1。

2.4.2 肝臟 正常對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞排列整齊，大小一致，細(xì)胞核圓形居中，核膜清晰無明顯改變;腹腔注射酵母多糖懸液各組大鼠均出現(xiàn)不同程度的肝小葉中央靜脈及周圍肝竇明顯擴(kuò)張淤血;肝細(xì)胞明顯腫脹、胞漿疏松或積水變性，但未見明顯灶性壞死。見圖2。

圖1 正常對(duì)照組與酵母多糖組大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)改變Fig.1 The histopathological change of lung in control group and zymosan group

圖2 正常對(duì)照組與酵母多糖組大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)改變Fig.2 The histopathological change of liver in control group and zymosan group

2.5 各組細(xì)胞因子水平比較與正常對(duì)照組比較:實(shí)驗(yàn)c組、d組中 TNF-α、IL-6、IL-10 均有顯著升高(P ＜0.01);b組 TNF-α、IL-6均有顯著升高(P＜0.01)，IL-10水平與正常對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P﹥0.05)。具體數(shù)值見表3。

3 討論

全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)是由感染因素和(或)非感染因素引起機(jī)體全身性、系統(tǒng)性瀑布樣持續(xù)過度釋放炎癥因子所致，而膿毒癥是感染因素引起的SIRS。過去認(rèn)為，在膿毒癥中微生物為炎癥反應(yīng)的觸發(fā)物，機(jī)體的病理生理反應(yīng)是由微生物引起的。但目前多項(xiàng)研究證實(shí)，膿毒癥是病菌引發(fā)的反應(yīng)和機(jī)體自身的病理生理改變兩方面共同參與的［5］。感染并不是炎癥反應(yīng)的唯一原因。此外，觸發(fā)因素不能完全影響炎癥反應(yīng)強(qiáng)弱。在Hukkanen的實(shí)驗(yàn)中，損傷的最終表現(xiàn)是由機(jī)體的免疫力、體質(zhì)和基因決定的。免疫反應(yīng)從某種程度上來說是基因的表現(xiàn)型，對(duì)于相同的損傷因素，某種特定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物易受到嚴(yán)重?fù)p傷，而其它的能自行恢復(fù)健康。同樣的危險(xiǎn)因素，高反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物發(fā)展為SIRS的機(jī)率大于細(xì)胞免疫反應(yīng)低的［2］。因此可以推測(cè)，損傷因素和患者本身的身體素質(zhì)決定了炎癥反應(yīng)的結(jié)局［3］。

表3 大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-10水平比較(±s)Table 3 The cytokine levels of rats in each group(±s)

表3 大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-10水平比較(±s)Table 3 The cytokine levels of rats in each group(±s)

24 h時(shí)d組2只大鼠死亡，10只大鼠參與檢測(cè);b、c、d組TNF-α，IL-6，IL-10檢測(cè)值分別與正常對(duì)照組(a)比較，*P＜0.01.

組 別24 h存活 TNF-α/pg·ml-1 IL-6/pg·ml-1 IL-10/ng·ml -1 12 4.50±2.03 105.78±43.09 1.37±0.17(b)酵母多糖懸液(500 mg/kg) 12 21.71±5.86* 385.63±75.93* 1.48±0.49(c)酵母多糖懸液(750 mg/kg) 12 30.87±6.81* 525.20±92.45* 1.95±0.17*(d)酵母多糖懸液(1 000 mg/kg) 10 66.30±10.50* 593.80±187.40* 2.20±0.20(a)正常對(duì)照組*

目前，制備MODS模型的實(shí)驗(yàn)研究較多，但SIRS模型的制作卻很少。由于較高的死亡率，MODS引起了人們的高度重視，人們進(jìn)行了大量MODS動(dòng)物模型的干預(yù)研究，然而卻在臨床試驗(yàn)中卻屢遭失敗，死亡率未見下降。作為MODS的前期表現(xiàn)，我們認(rèn)為SIRS的早期診斷、早期治療更加重要。如果能在SIRS階段進(jìn)行有效的干預(yù)，可以從根本上減少M(fèi)ODS的發(fā)生，從而降低病死率［8］。

制備SIRS動(dòng)物模型的方法很多，較常用的有盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(CLP)，急性重癥胰腺炎動(dòng)物模型，細(xì)菌、LPS等誘導(dǎo)的SIRS模型［9］。這4種都引進(jìn)了外源性感染因素，難以排除感染等外因干擾，不能完全反映上述所描述的SIRS本質(zhì)。而酵母多糖是一種激活劑，它能激活補(bǔ)體系統(tǒng)、前列腺素、白三稀、血小板聚集因子、氧自由基、溶菌酶和巨噬細(xì)胞等［2］，將其注入大鼠體內(nèi)，會(huì)造成嚴(yán)重的腹腔炎癥，但不引入外源性感染，為非感染因素引起的SIRS，與上述描述的SIRS無論是臨床表現(xiàn)還是病理改變都較符合。此種炎癥反應(yīng)模型的可取之處在于致病因素簡(jiǎn)單明確，便于復(fù)制，具有明顯的SIRS表現(xiàn)［9］。

腹膜是人體內(nèi)面積最大的上皮組織，受到感染或非感染因素刺激時(shí)，易于誘發(fā)SIRS［11-12］。因此，本研究采用腹腔注射途徑以酵母多糖-石蠟懸液作為刺激物，制備SD大鼠急性腹膜炎模型以誘發(fā)SIRS。當(dāng)腹腔注射500 mg/kg酵母多糖的ZPS時(shí)，大鼠SIRS現(xiàn)象不明顯，若注射劑量分別增加至含750 mg/kg和1 000 mg/kg時(shí)，均能有效誘導(dǎo)大鼠SIRS的發(fā)生，尤其是使用高劑量(1 000 mg/kg)時(shí)，可導(dǎo)致大鼠注射后48 h內(nèi)出現(xiàn)高病死率，且多次試驗(yàn)結(jié)果均相似。

SIRS相關(guān)細(xì)胞因子種類繁多，包括TNF-α、IL-1、IL-2、IL-6、IL-10、IL-13 等，SIRS 時(shí)主要表現(xiàn)為上述因子失控性合成與釋放、啟動(dòng)炎癥反應(yīng)級(jí)聯(lián)放大并形成網(wǎng)絡(luò)式交互作用［14-15］。在SIRS及 MODS發(fā)病過程中，以細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-10 最為重要［14-16］。TNF-α 是SIRS時(shí)啟動(dòng)炎癥因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)的始發(fā)因子，不僅可以激活各種炎性細(xì)胞，其本身也是一種致熱原，同時(shí)還可降低血管張力、心肌收縮力及增加血管通透性［17-18］。Miyaoka 等［13］的研究顯示外科手術(shù)后第一天患者IL-6和IL-10水平上升，且IL-6濃度以及IL-6與IL-10之比在SIRS患者中較非SIRS患者為高，由此得出檢測(cè)血清TNF-α、IL-6與IL-10水平可作為一種預(yù)測(cè)SIRS的方法。

上述結(jié)果表明，酵母多糖誘導(dǎo)大鼠SIRS有劑量依賴性和高重復(fù)性，穩(wěn)定可靠的大鼠SIRS模型可作為SIRS發(fā)病機(jī)制研究、藥物篩選等的有效工具。

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