朱 蕾，陳 智，陳建忠，王 靜，胡中榮，陳離偉，劉榮華，胡敏君，朱海紅

(1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院傳染病診治國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州310003;2.浙江大學(xué)免疫研究所，浙江杭州310058)

在我國，乙型肝炎病毒(HBV)相關(guān)性肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)發(fā)病率、死亡率均排名于疾病譜前列，嚴(yán)重危害人民健康［1-3］。近來，許多研究表明宿主和某些病毒都可以編碼微小 RNA(microRNA，miRNA)，在調(diào)控病毒生命周期及病毒與宿主相互作用的過程中起到非常關(guān)鍵的作用［4-7］。

人類miR-122是一種肝臟特異性表達(dá)的微小RNA，約占肝臟總miRNA的70%。它位于人第 18 號(hào)染色體上的，定位于 18q21.31［8］。近來研究表明，miR-122不僅與丙型肝炎的復(fù)制相關(guān)［10］，而且在肝細(xì)胞肝癌組織中以及所有的肝細(xì)胞肝癌衍生的細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)［9-10］。為了探索miR-122和HBV致病機(jī)制的關(guān)系，我們利用體外穩(wěn)定表達(dá)HBV的HepG2.2.15細(xì)胞模型，利用合成的miRNA和反義技術(shù)調(diào)控細(xì)胞miR-122水平，探索miR-122水平和HBV表達(dá)之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 HepG2.2.15細(xì)胞為本所常規(guī)傳代保 存。LipofectamineTM2000、Opti-MEM I reduced serum medium、Trizol均購自美國Invitrogen公司。G418購自美國Hyclone公司。RNase Inhibitor、 MultiScribeTMReverse Transcriptase、dNTPs、10 × Reverse Transcription Buffer、Nuclease-free water、RT primer、TaqMan 2×Universal PCR Master Mix、No AmpErase UNG均購自美國 Applied Biosystems公司。HBV DNA定量試劑盒購自杭州博康有限公司。

hsa-miR-122由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成，鎖核酸修飾的LNA-anti-miR122由美國Sigma公司合成，anti-miR-122由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成，anti-GFP由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成，其設(shè)計(jì)如下:

1.2 方法

1.2.1 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞并分組培養(yǎng) 常規(guī)培養(yǎng)HepG2.2.15細(xì)胞于含10%胎牛血清、G418 600 μg/ml的 DMEM 完全培養(yǎng)液中。轉(zhuǎn)染前1天將細(xì)胞以1×105∕孔細(xì)胞接種于12孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞融合率達(dá)到80% ～90%，用優(yōu)化培養(yǎng)基(Opti-MEM I reduced serum medium)清洗2次，按照 LipofectamineTM2000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。設(shè):hsa-miR-122組、anti-GFP組、anti-miR122組和LNA anti-miR122組，其終濃度分別為 400 nmol/L、400 nmol/L、400 nmol/L和40 nmol/L。轉(zhuǎn)染5 h后，將培養(yǎng)基更換為含10%胎牛血清和600 μg/ml G418的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染24 h收集上清，轉(zhuǎn)染48 h后收集上清和細(xì)胞。

1.2.2 時(shí)間分辨免疫熒光法檢測(cè)HBsAg和HBeAg含量 收集轉(zhuǎn)染24 h和48 h后各組HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)上清，時(shí)間分辨免疫熒光法檢測(cè)HBsAg和HBeAg含量。檢測(cè)方法按照試劑盒說明書。

1.2.3 定量PCR檢測(cè)HBV-DNA含量 收集轉(zhuǎn)染24 h和48 h后各組HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)上清，熒光定量 PCR法檢測(cè)上清中 HBV DNA含量，檢測(cè)病毒最低限值為500 copies/ml。操作方法按照試劑盒說明書。

1.2.4 熒光定量PCR檢測(cè)各組miR-122含量

轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，操作按照美國Invitrogen公司Trizol試劑說明書。逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA按照 TaqMan?MicroRNA Assays中說明書進(jìn)行 RNA逆轉(zhuǎn)錄。0.15 μl 100 mmol/L dNTPs，1 μl MultiScribeTMReverse Transcriptase，1.50 μl 10 × Reverse Transcription Buffer，0.19 μlRNase Inhibitor，4.16 μl Nuclease-free water，5 μl 總 RNA，3 μl RT primer，混合均勻。16℃水浴 30 min，42℃水浴30 min，85℃水浴5 min，終止反應(yīng)，4℃冷卻，-20℃凍存?zhèn)溆谩⒄?TaqMan?MicroRNA Assays說明書，PCR反應(yīng)體系:TaqMan?2×Universal PCR Master Mix(No AmpErase?UNG)10.00 μl，TaqMan?MicroRNA Assays 20 ×TaqMan?Assay 1.00 μl，RT Product 1.33 μl，Nuclease Free Water 7.67 μl，一共 20 μl。使用Applied Biosystems 7500 Real-time PCR 儀，95℃預(yù)變性 10 min，95℃變性 15 s，60℃退火/延伸60 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件包統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料各組數(shù)據(jù)均采用“均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差”(±s)來表示，多組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，有顯著差異時(shí)作兩兩比較的q檢驗(yàn)，最后再作顯著性P檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染后HepG2.2.15細(xì)胞miR-122相對(duì)表達(dá) 轉(zhuǎn)染48 h后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組HepG2.2.15細(xì)胞miR-122相對(duì)表達(dá):anti-miR-122組、LNA-antimiR-122組miR-122表達(dá)明顯受抑制，顯著低于陰性對(duì)照組(P＜0.001)。hsa-miR-122組miR-122表達(dá)較陰性對(duì)照組升高，有顯著性差異(P＜0.001)。見圖1。

圖1 轉(zhuǎn)染48 h后HepG2.2.15細(xì)胞miR-122相對(duì)表達(dá)量Fig.1 Relative expression level of miR-122 in HepG2.2.15 cells 48 h post-trans-fection

2.2 轉(zhuǎn)染后HepG2.2.15細(xì)胞上清中HBsAg與HBeAg的表達(dá) 轉(zhuǎn)染24 h及48 h后，anti-miR-122組與 LNA-antimiR-122組 HBsAg表達(dá)均無差異(P=1.000)。hsa-miR-122組HBsAg表達(dá)均顯著低于陰性對(duì)照組(P＜0.01)和anti-miR-122組、LNA-antimiR-122組(P＜0.001)。anti-miR-122組、LNA-antimiR-122組HBsAg表達(dá)均顯著高于陰性對(duì)照組(P＜0.001)。見圖2A。

轉(zhuǎn)染24 h及48 h后，anti-miR-122組與LNA-antimiR-122組HBeAg表達(dá)均無差異(P=1.000)。hsa-miR-122組HBeAg表達(dá)均顯著低于陰性對(duì)照組(P＜0.01)和 anti-miR-122組、LNA-antimiR-122組(P＜0.001)。anti-miR-122組、LNA-antimiR-122組HBeAg表達(dá)均顯著高于陰性對(duì)照組(P＜0.001)。見圖2B。

圖2 轉(zhuǎn)染24 h及48 h后HepG2.2.15細(xì)胞上清中HBsAg與HBeAg的表達(dá)Fig.2 Expression level of HBsAg and HBeAg in the supernatant24 h and 48 h post-transfection

2.3 轉(zhuǎn)染后HepG2.2.15細(xì)胞上清中HBV DNA的表達(dá) 轉(zhuǎn)染24 h與48 h后各組HBV DNA表達(dá)與陰性對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

3 討論

miR-122是肝臟特異性表達(dá)的miRNA，約占肝臟miRNAs表達(dá)的70%。這種調(diào)節(jié)肝臟發(fā)育的“肝特異性miRNA”，在肝臟的發(fā)育和分化及維持肝臟正常功能中發(fā)揮重要的作用。而應(yīng)用反義寡聚核苷酸使miR-122失活后，出現(xiàn)肝臟功能受損、膽固醇合成降低，提示miR-122不僅參與肝臟分化的調(diào)節(jié)，還在維持肝臟正常功能中起著重要作用［11］。

Jopling等［10］發(fā)現(xiàn)，人類肝臟特異性的miR-122通過靶向結(jié)合HCV mRNA 5＇非編碼區(qū)并與之相互作用誘發(fā)病毒復(fù)制，是一種正調(diào)控基因表達(dá)的方式。miR-122可以與丙肝病毒基因組相互作用調(diào)節(jié)丙型肝炎病毒的表達(dá)，當(dāng)miR-122被滅活，丙型肝炎病毒復(fù)制水平明顯降低。

HepG2.2.15細(xì)胞是體外研究HBV復(fù)制較為理想的細(xì)胞模型［12］。它來源于 HepG2細(xì)胞，整合了ayw型HBV全基因組，能夠部分模擬HBV的生活周期，這一細(xì)胞系可以成功表達(dá)HBV的全部病毒標(biāo)志，包括HBV DNA、HBsAg、HBeAg、HBcAg、HBVDNAp 等，而且還能產(chǎn)生大量的復(fù)制中間體，與自然狀態(tài)的病毒顆粒一樣具有感染性，且更接近于人體肝細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的實(shí)際情況，被研究者廣泛應(yīng)用于HBV復(fù)制的研究。我們實(shí)驗(yàn)選用HepG2.2.15細(xì)胞為研究對(duì)象，為miRNA與HBV自然感染的臨床應(yīng)用研究提供更加客觀的依據(jù)。

本研究為了探索miR-122這個(gè)肝臟特異性豐富表達(dá)的miRNA是否也與HBV復(fù)制相關(guān)，設(shè)計(jì)體外轉(zhuǎn)染 HepG2.2.15細(xì)胞，調(diào)控細(xì)胞miR-122水平，觀察轉(zhuǎn)染不同時(shí)間內(nèi)細(xì)胞分泌HBeAg和HBsAg及HBV DNA復(fù)制情況，并通過熒光定量PCR方法檢測(cè)各組miR-122的含量，進(jìn)一步探索miR-122和HBV表達(dá)之間的關(guān)系。我們發(fā)現(xiàn)miR-122與HBsAg、HBeAg的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，抑制細(xì)胞內(nèi)miR-122水平，HBsAg與HBeAg的表達(dá)增加，上調(diào)細(xì)胞內(nèi)miR-122水平，HBsAg與HBeAg的表達(dá)降低。目前已有研究表明，miR-122在大多數(shù)原發(fā)性肝癌中以及原發(fā)性肝癌衍生的細(xì)胞系中是下調(diào)的。且研究表明，HBeAg與HBsAg均陽性的HBV患者患原發(fā)性肝癌的危險(xiǎn)率上升［13-14］。這些有可能表明HBeAg與HBsAg，miR-122與HBV相關(guān)原發(fā)性肝癌之間存在一些調(diào)控機(jī)制。miR-122的下調(diào)促進(jìn)原發(fā)性肝癌的發(fā)生發(fā)展，促進(jìn)HBV高表達(dá) HBeAg與 HBsAg。而持續(xù)的 HBeAg與HBsAg高表達(dá)，更加促進(jìn)了HBV患者肝臟的炎癥反應(yīng)及加速HBV相關(guān)肝癌的發(fā)生進(jìn)程。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，miR-122與HBV DNA復(fù)制無明顯相關(guān)性，但miR-122可以降低HBV蛋白的表達(dá)，從某種角度上說明miR-122參與調(diào)節(jié)HBV的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。miR-122如何通過調(diào)節(jié)靶基因，繼而調(diào)節(jié) HBV表達(dá) HBeAg與HBsAg的機(jī)制，還需進(jìn)一步探索。

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