李蘇娟，陳 智，朱海紅

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院傳染病診治國家重點實驗室，浙江杭州310003)

丙型肝炎病毒(HCV)是導(dǎo)致肝臟疾病的一個重要病原體，約80%的HCV感染者會發(fā)展為慢性肝炎［1］。目前，IFN-α 聯(lián)合利巴韋林(RBV)是治療慢性丙型肝炎(CHC)的標(biāo)準(zhǔn)方案，但僅有約50%患者能獲得持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答(SVR)［2］，這與宿主、病毒和 IFN 等因素有關(guān)［3-4］。miR-122是一種肝臟特異性的miRNA，占肝臟總miRNA表達(dá)量的70%［5］，與肝臟的發(fā)育、代謝及癌癥有關(guān)［6-7］。近年來，Jopling等［8］發(fā)現(xiàn)miR-122促進(jìn)HCV的復(fù)制，系第一個被證明與病毒復(fù)制成正相關(guān)的宿主miRNA。本研究旨在探討miR-122是否影響IFN-α的抗HCV效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和細(xì)胞 含有HCV全長基因組的質(zhì)粒pFL-Jc1由美國Apath公司惠贈，Huh7.5.1細(xì)胞來自美國斯克利普斯研究所Scott Forrest教授，由中國科學(xué)院上海巴斯德研究所鐘勁教授提供。

1.1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、FBS和Opti-MEM 購自Gibco公司，IFN-α購自PBL公司，Trizol和 LipofectamineTM2000 購自Invitrogen公司，限制性內(nèi)切酶Xba、綠豆核酸酶、蛋白酶 K、DNA marker、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green Taq試劑盒均購自Takara公司，T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(T7 RiboMAXTMExpress Large Scale RNA Production System)購自 Promega公司，RNeasy Mini Kits購自Qiagen公司。

1.1.3 引物 U6和miR-122的逆轉(zhuǎn)錄引物和上下游引物均購自廣州銳博公司。GAPDH上游和下游引物分別為GAAGGTGAAGGTC GAGTC和GAAGATGGTGATGGGATTTC;HCV 5＇UTR上游和下游引物分別為GCGTTAGTAT GAGTGTCGTG 和 TCGCAAGCACCCTATCAG，均由Invitrogen公司合成。

1.2 方法

1.2.1 HCV pFL-JC1的線性化 取質(zhì)粒44 μl，加入1 μl限制性內(nèi)切酶 Xba 及5 μl相應(yīng)緩沖液，37℃孵育2 h，使質(zhì)粒線性化，取2 μl反應(yīng)液以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切消化完全。用酚氯仿法純化DNA后，分別以綠豆核酸酶和蛋白酶K處理，再用酚氯仿法抽提純化DNA，用12 μl水溶解 DNA，取1 μl跑電泳檢測酶切消化后DNA片段的大小。

1.2.2 體外轉(zhuǎn)錄 以2 μg上述線性化的DNA為模板，用promega T7 RiboMAXTMRNA體外轉(zhuǎn)錄試劑盒對模板體外轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為20 μl，37℃ 孵育 2 h。RNA 產(chǎn)物用 RNeasy Mini Kits純化，最后用50 μl無RNA酶水洗滌，保存于-80℃。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng) Huh7.5.1細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育。

1.2.4 HCV細(xì)胞感染模型的建立 轉(zhuǎn)染前1天，以4×105個/孔密度接種12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞融合度為70% ～80%。轉(zhuǎn)染時，取1.5 μg HCV RNA轉(zhuǎn)錄體，用100 μl Opti-MEM無血清培養(yǎng)基稀釋，輕輕混勻，室溫放置5 min;取2 μl LipofectamineTM2000，用1 00 μl Opti-MEM 無血清培養(yǎng)基稀釋，輕輕混勻，室溫放置5 min。將稀釋的HCV RNA和LipofectamineTM2000一起輕輕混合，室溫靜置20 min。將200 μl復(fù)合物加入12孔板的細(xì)胞中，輕輕混勻。6 h后換液，換為完全培養(yǎng)基。3天后，收集上清和未處理的Huh7.5.1細(xì)胞一起孵育3h，換為普通DMEM完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)3天后即進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.5 IFN-α處理和miR-122 mimics轉(zhuǎn)染本實驗中IFN-α的作用終濃度參照文獻(xiàn)［9］，為1 000 IU/ml，作用時間為48 h。miR-122 mimics的轉(zhuǎn)染步驟同方法1.2.4，轉(zhuǎn)染終濃度和時間分別為20 nmol/L、100 nmol/L和400 nmol/L和72 h。

1.2.6 HCV的逆轉(zhuǎn)錄和實時定量PCR 按Trizol法提取總RNA。基因組DNA去除反應(yīng)包括5 ×gDNA Eraser緩沖液2 μl、gDNA Eraser 1 μl、無 RNA 酶水 3 μl和總 RNA 模板 4 μl，反應(yīng)條件為42℃ 2 min。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系包括5× 反轉(zhuǎn)錄緩沖液 4 μl、反轉(zhuǎn)錄酶 1 μl、反轉(zhuǎn)錄引物混合液1 μl、無RNA 酶水4 μl和 DNA 去除反應(yīng)液 10 μl，逆轉(zhuǎn)錄條件為 37℃ 15 min，85℃5 s。合成的cDNA作為實時定量PCR模板，反應(yīng)體系包括2×SYBR Green Taq反應(yīng)液10 μl、HCV或GAPDH的正反義引物各0.4 μl、Rox 0.4 μl，滅菌蒸餾水 4.8 μl和 cDNA 模板 4 μl。實時定量PCR反應(yīng)條件為95℃ 30 s，共1個循環(huán);95℃ 5 s，60℃ 34 s，共 40 個循環(huán)。IFN-α抑制率(%)=［(IFN-α處理前HCV RNA相對表達(dá)量-IFN-α處理后 HCV RNA相對表達(dá)量)/IFN-α處理前HCV RNA相對表達(dá)量］×100%，用來衡量IFN-α的抗病毒作用。

1.2.7 miRNA的逆轉(zhuǎn)錄和實時定量PCR 按Trizol法提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系包括5× 反轉(zhuǎn)錄緩沖液 2 μl、逆轉(zhuǎn)錄酶 0.5 μl、U6 或miR-122的特異性逆轉(zhuǎn)錄引物2 μl、無RNA酶水 3 μl和總 RNA 模板 2.5 μl，逆轉(zhuǎn)錄條件為42℃ 15 min，85℃ 5 s。合成的cDNA作為實時定量PCR模板，反應(yīng)體系包括2×SYBR Green Taq反應(yīng)液10 μl、miR-122或U6的正反義引物各 2 μl、Rox 0.4 μl，滅菌蒸餾水 1.6 μl 和cDNA模板4 μl，PCR反應(yīng)條件同方法1.2.6。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)分析 用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，每個實驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以±s表示。多組均數(shù)間比較采用One-Way ANOVA，兩組均數(shù)之間比較采用 student-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IFN-α對HCV RNA復(fù)制的影響 經(jīng)IFN-α 處理 0.5 h、2 h、8 h、24 h、48 h 后，Huh7.5.1細(xì)胞內(nèi)的HCV RNA分別降至原來的94%、98%、79%、54%、17%(見圖1)，與 IFN-α 作用呈時間依賴性，在48 h時降至最低，作為后續(xù)實驗的作用時間。

圖1 感染HCV的Huh7.5.1細(xì)胞經(jīng)1 000 IU/ml IFN-α處理不同時間后的HCV RNA相對表達(dá)量Fig.1 The relative expression levels of HCV RNA at different time points in Huh 7.5.1 cells infected with HCV after treating with 1 000 IU/ml IFN-α

2.2 miR-122對HCV復(fù)制的影響 Huh7.5.1細(xì)胞感染HCV 72 h后，轉(zhuǎn)染終濃度為20 nmol/L、100 nmol/L 和400 nmol/L 的miR-122 mimics，72 h后檢測細(xì)胞內(nèi)的HCV RNA相對表達(dá)量分別為12.70±3.75、15.3±1.81和24.9±6.58，均明顯高于對照組(P＜0.05)。見圖2。

圖2 感染HCV的Huh7.5.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染不同濃度miR-122 mimics后HCV RNA相對表達(dá)量Fig.2 The relative expression levels of HCV RNA in Huh7.5.1 cells infected with HCV after transfecting different concentrations of miR-122 mimics

2.3 miR-122對IFN-α抗HCV效應(yīng)的影響1 000 IU/ml IFN-α作用于轉(zhuǎn)染miR-122 mimics 20 nmol/L、100 nmol/L、400 nmol/L 各組 48 h后，HCV RNA相對表達(dá)量分別為3.47±1.34、5.47±1.42、10.33±2.7，隨 miR-122濃度增加而增高，并且后兩組明顯高于對照組(P＜0.01)，見圖3。由于 IFN-α處理前，各組的HCV RNA水平不一樣，我們用IFN-α抑制率來衡量IFN-α在各組的抗病毒作用。20 nmol/L組、100 nmol/L組和4 00nmol/L組的IFN-α抑制率分別為73.3% ±3.5%、64.67% ±5.5%和56.33% ±5.1%，明顯低于對照組的84% ±4.5%(P＜0.05或P＜0.01)，見圖4。

圖3 轉(zhuǎn)染不同濃度miR-122 mimics的Huh7.5.1細(xì)胞給予1 000 IU/ml IFN-α處理后細(xì)胞內(nèi)的HCV RNA相對表達(dá)量Fig.3 The relative expression levels of HCV RNA in Huh7.5.1 cells transfected with different concen-trations of miR-122 mimics after treating with 1 000 IU/ml IFN-α

2.4 HCV載量對IFN-α抗病毒作用的影響由于還存在一個變量，即各組的HCV RNA表達(dá)量不同，接下來的實驗來證明IFN-α抗HCV的作用是否與HCV的病毒載量有關(guān)。給Huh7.5.1 分別感染 107拷貝、106拷貝、105拷貝HCV，1 000 IU/ml IFN-α 作用 48 h 后各組的IFN-α抑制率分別為82.33% ±5%、90.33% ±7.6%和95% ±1.5%(圖5)，105拷貝組 IFN-α抑制率明顯高于107拷貝組(P＜0.05)。

3 討論

由于缺乏有效的細(xì)胞模型和小動物模型，限制了對HCV生活周期和宿主-病毒之間相互作用的研究以及抗病毒藥物和疫苗的研發(fā)。到目前為止，關(guān)于HCV的研究多僅限于HCV患者［10］和大猩猩［11］。隨后在人肝源 Huh7 細(xì)胞株建立的HCV復(fù)制子系統(tǒng)使得對于HCV翻譯和復(fù)制的研究成為可能［12-13］。然而，這些復(fù)制子并不能產(chǎn)生感染性的 HCV顆粒。Kato等［14-15］人從一名爆發(fā)性丙型肝炎患者體內(nèi)分離出一株HCV全長基因克隆，以之構(gòu)建的復(fù)制子能夠在Huh7細(xì)胞及其他肝源性細(xì)胞和非肝源性細(xì)胞中有效的復(fù)制。接著，這個研究小組用體外轉(zhuǎn)錄的JFH-1 RNA轉(zhuǎn)染Huh7，發(fā)現(xiàn)在上清分泌有感染性病毒顆粒。然而，在JFH-1 RNA轉(zhuǎn)染的Huh7細(xì)胞中，病毒復(fù)制率和感染性差，并且將感染性上清孵育na?ve Huh7細(xì)胞后，病毒不能復(fù)制傳代。Blight等［16］人用 IFN-α長期處理含HCV復(fù)制子的Huh7細(xì)胞，消除HCV復(fù)制子，獲得對HCV易感的Huh7.5細(xì)胞株。Zhong等［17］用 IFN-γ長期處理含有 I/5AGFP-6復(fù)制子的Huh7.5細(xì)胞，獲得對HCV更易感的 Huh7.5.1細(xì)胞株。將 JFH-1轉(zhuǎn)染Huh7.5.1細(xì)胞，能高效地分泌出感染性HCV顆粒，可重復(fù)感染Huh7.5.1細(xì)胞和黑猩猩。本研究中，我們利用高復(fù)制效能的JC-1株和易感性更高的Huh7.5.1細(xì)胞建立的HCV細(xì)胞感染模型，更加接近HCV的天然生活周期。由于臨床上IFN-α為治療HCV的主要藥物，我們用IFN-α處理此細(xì)胞模型，觀察其對HCV RNA復(fù)制的影響，結(jié)果顯示，在IFN-α作用0.5h和2h時，HCV RNA沒有明顯下降，之后，在8h時才開始下降，24h已降至原來的一半，48h時降至17%，以此作為后續(xù)實驗的時間點。

在本研究中，我們觀察miR-122在細(xì)胞感染模型中對HCV復(fù)制的影響，結(jié)果表明，隨著miR-122水平的增高，HCV RNA的相對表達(dá)量也明顯升高，提示在感染模型中，miR-122促進(jìn)HCV的復(fù)制，并且呈濃度依賴性。

我們觀察miR-122對IFN-α抗HCV效應(yīng)的影響，發(fā)現(xiàn):隨著miR-122水平的增高，IFN-α抑制率逐漸下降。由于除了miR-122這個變量外，還有一個變量——HCV載量，因此，我們給Huh7.5.1細(xì)胞感染不同載量的HCV后，給予IFN-α處理，觀察HCV載量對IFN-α抑制率的影響。結(jié)果顯示，HCV載量影響IFN-α抑制率，感染 HCV載量越多，IFN-α抑制率越低。由此推測，miR-122的表達(dá)可部分中和 IFN-α的抗HCV效應(yīng)。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了HCV細(xì)胞感染模型，在此模型中miR-122促進(jìn)HCV的復(fù)制。并且，進(jìn)一步實驗還發(fā)現(xiàn)，miR-122的表達(dá)可部分中和IFN-α的抗HCV效應(yīng)。

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