姚 毅，譚喜瑩，王淑云，朱萱萱

江蘇省中醫(yī)院，南京 210029

復(fù)方首烏軟膠囊是江蘇省中醫(yī)院傳統(tǒng)中藥制劑，主要由赤白首烏、地黃、牛膝、桑椹、女貞子、墨旱蓮、桑葉、菟絲子、金櫻子、黑芝麻、金銀花等14味中藥組成，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、烏須發(fā)的功效。臨床實(shí)踐表明，復(fù)方首烏軟膠囊具有良好的抗衰老作用。藥理實(shí)驗(yàn)證明，復(fù)方首烏軟膠囊具有降低機(jī)體耗氧量,增加供氧量的作用，可明顯延長(zhǎng)小鼠游泳時(shí)間[1]。復(fù)方首烏軟膠囊還可以增強(qiáng)機(jī)體內(nèi)源性抗衰老物質(zhì)SOD活性，從而抑制自由基對(duì)細(xì)胞的損害[2]。近年來的研究表明，基因是主導(dǎo)生物衰老過程的主要原因，衰老過程中多數(shù)原癌基因的表達(dá)或產(chǎn)物活性降低，抑癌基因則相反。p16基因是一種主要抑癌基因，p16的積累是衰老的誘因。抑制p16的表達(dá)，雖然不激活端粒酶，但是能減慢端粒的縮短，并增強(qiáng)DNA損傷修復(fù)能力，從而延緩了衰老的進(jìn)程[3]。本實(shí)驗(yàn)采用D-半乳糖誘發(fā)的亞急性衰老模型，采用熒光定量PCR（Realtime-PCR）法檢測(cè)小鼠腦中p16基因的表達(dá)，探討復(fù)方首烏軟膠囊對(duì)衰老基因p16表達(dá)的影響，進(jìn)一步闡明復(fù)方首烏軟膠囊抗衰老作用的生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材 料

1.1 藥品

復(fù)方首烏軟膠囊（江蘇省中醫(yī)院制劑部）；活力蘇口服液（主要成分:制何首烏、淫羊藿、黃精、枸杞、黃芪、丹參；成都地奧集團(tuán)天府藥業(yè)股份有限公司，批號(hào):100202）；D-半乳糖（美國(guó) Sigma公司，批號(hào):G-0625）；Trizol試劑 （Invitrogen公司）；AMV反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega公司）；Realtime-PCR引物由南京金思瑞生物公司合成；SYBR Green I核苷酸膠體染料（Invitrogen 公司）；Taq PCR Master Mix Kit（Qiagen公司）。

1.2 動(dòng)物

ICR小鼠，由揚(yáng)州大學(xué)提供，合格證號(hào):蘇SCXK（蘇）2007-0001。給藥前后小鼠分籠飼養(yǎng)，喂全價(jià)顆粒飼料，自由飲水。 室溫（20±2）℃，濕度 55%～65%。

1.3 儀器

DNA電泳儀 （Pharmacia公司）；Eppendorf Biophotometer蛋白核酸測(cè)定儀（Eppendorf公司）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Hermle公司）；凝膠圖像分析系統(tǒng)（Pharmacia公司）；iCycler iQ system型熒光定量 PCR 儀 （Bio-Rad Laboratories）；Opticon Monitor 2定量PCR儀 （美國(guó)MJ公司）；SDS-PAGE 電泳及電轉(zhuǎn)印裝置（上海天能公司）。

2 方 法

2.1 動(dòng)物模型制備及分組

取ICR小鼠，雌雄各半，體重18～22 g，隨機(jī)分5組，每組 10 只。（1）空白對(duì)照組:20 mL·kg-1生理鹽水（NS）；（2）模型對(duì)照組:20mL·kg-1生理鹽水；（3）陽性藥組（活力蘇口服液組）:20mL·kg-1；（4）復(fù)方首烏軟膠囊小劑量組:20g·kg-1；（5）復(fù)方首烏軟膠囊大劑量組:40g·kg-1。 以上各組小鼠除空白對(duì)照組外其它4組每天皮下注射1.2%的D-半乳糖溶液0.01 mL·g-1，同時(shí)每天給予復(fù)方首烏軟膠囊溶液灌胃治療；陽性藥組給予活力蘇口服液對(duì)照；空白對(duì)照組和模型組給予生理鹽水，給藥容量均為20mL·kg-1。40天后處死小鼠，取大腦。

2.2 標(biāo)本的采集與測(cè)定

2.2.1 標(biāo)本的采集 取腦部海馬組織50 mg，組織塊直接放入研缽中，加入少量液氮，迅速研磨，待組織變軟，再加少量液氮，再研磨，重復(fù)3次，按50 mg組織加入1 mL Trizol。將懸液移入1.5 mL EP管中，加入氯仿-Trizol（V∶V=1∶5）溶液，振蕩混勻后室溫放置 15 min。然后于 4 ℃、12000 r·min-1離心 15 min，取水相，加入0.5 mL異丙醇，混勻，室溫放置10 min。 4 ℃、12000 r·min-1離心 10 min，棄上清液，加入用焦碳酸二乙酯 （DEPC）處理的75%乙醇1 mL洗滌沉淀。于 4℃，12000 r·min-1離心 5 min 后，盡可能將乙醇吸凈，室溫下干燥5～10 min，用20μL DEPC水溶解，-20℃低溫保存。

2.2.2 使用Realtime-PCR檢測(cè)p16 mRNA表達(dá)水平 根據(jù)文獻(xiàn)，p16基因引物設(shè)計(jì)如下:上游引物UP:5′-TGTTCTCTCTGGCAGGTCAT-3′， 下游引物Down:5′-CTAGATCACTCAGTCCTCAC-3′；β-actin:5′-CCCGCGAGCACAGCTTCTTT-3′，5′-ATACAGCCCGGGGAGCATCG-3′，預(yù)期p16基因擴(kuò)增產(chǎn)物為342bp，β-actin內(nèi)參基因擴(kuò)增產(chǎn)物為153bp。

使用Bio-Rad iCycler iQ system(Bio-Rad Laboratories)，按照以下條件進(jìn)行熒光定量PCR。反應(yīng)體系為:10×Buffer 2.5μL，三磷酸脫氧核糖核苷（dNTP，10 mmol·L-1）1μL，MgCl2（25 mmol·L-1）1.5μL， 上游引物 （10 pmol·L-1）1.5μL， 下游引物（10 pmol·L-1）1.5μL，Taq DNA 聚合酶（5 U·μL-1）0.2μL，SYBR Green I核酸染料（ 0.5×） 1μL，cDNA 模板2μL，加無核酶水至 25μL。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性4 min，94℃30 s，60℃30 s，72℃30 s，40 個(gè)循環(huán)。 反應(yīng)結(jié)束后，分別計(jì)算CT值，每個(gè)樣本重復(fù)6次，以平均數(shù)值來表示結(jié)果。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用2-△CT方法計(jì)算RNA的相對(duì)含量（相對(duì)于βactin的表達(dá)量）。數(shù)據(jù)分析采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行，多組間比較采用單因素方差分析 （one-way ANOVA）。 結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（x）表示，兩兩組間多重比較采用LSD方法進(jìn)行檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 RNA的提取

提取的總RNA用紫外分光光度計(jì)鑒別其濃度和純度，所有RNA樣品的A260/A280的比值均在1.8～2.0之間，表明RNA純度較好，可以用來做Realtime-PCR。

3.2 熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)果

在海馬中，與正常組比較，衰老模型組p16基因mRNA表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.01）；經(jīng)藥物治療后復(fù)方首烏軟膠囊大劑量組、復(fù)方首烏軟膠囊小劑量組均能明顯降低腦組織中p16 mRNA表達(dá)，與模型組比較P＜0.01。提示疏肝益腎方延緩衰老的作用與降低衰老基因p16的表達(dá)有關(guān)。結(jié)果見表1。

Real-time PCR產(chǎn)物通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物專一性，結(jié)果見圖1。

表1 復(fù)方首烏軟膠囊對(duì)小鼠腦海馬組織p16 mRNA表達(dá)的影響（x，n=10）

表1 復(fù)方首烏軟膠囊對(duì)小鼠腦海馬組織p16 mRNA表達(dá)的影響（x，n=10）

注:與空白對(duì)照組；**P＜0.01

圖1 引物專一性檢測(cè)電泳圖

4 討 論

p16基因是一種重要的抑癌基因。近年來發(fā)現(xiàn)它在細(xì)胞衰老過程中起重要作用。研究表明，當(dāng)成纖維細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、尿道上皮細(xì)胞等進(jìn)入衰老時(shí)p16均過度表達(dá)，其持續(xù)表達(dá)導(dǎo)致了細(xì)胞衰老[4]。另一方面，Duan等[5-6]以p16正反義載體分別轉(zhuǎn)染年輕的人成纖維細(xì)胞(ZBS)，發(fā)現(xiàn)p16過表達(dá)抑制了視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因產(chǎn)物（RB）的磷酸化，進(jìn)而引起細(xì)胞早衰，而其反義載體轉(zhuǎn)染可以延緩細(xì)胞衰老。因此p16的積累不是衰老的結(jié)果，而是衰老的誘因。因此，抑制p16的表達(dá)，可有效延緩衰老的進(jìn)程[7]。

本實(shí)驗(yàn)通過觀察復(fù)方首烏軟膠囊對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠p16 mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其能降低p16基因相對(duì)表達(dá)，這可能與其抗衰老作用機(jī)制相關(guān)，并且復(fù)方首烏軟膠囊在較低劑量下就能有效地降低p16 mRNA的表達(dá)，從而起到抗衰老的作用。本文從分子水平探討復(fù)方首烏軟膠囊抗衰老的機(jī)理，為復(fù)方首烏軟膠囊的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為中藥防治衰老提供一定的科學(xué)理論依據(jù)，為開發(fā)抗衰老中藥、發(fā)揚(yáng)祖國(guó)的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)提供新的思路。

[1]張忠華，白茹芹，沈 源.首烏軟膠囊抗應(yīng)激及衰老作用研究[J]. 南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，24（5）:338-40.

[2]張忠華，朱萱萱，王淑云，等.首烏軟膠囊對(duì)D-半乳糖致亞急性衰老小鼠的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2009，27（4）:765-6.

[3]胡作為，周燕萍，沈自尹.p16基因與細(xì)胞衰老關(guān)系的研究進(jìn)展[J]. 國(guó)外醫(yī)學(xué)(遺傳學(xué)分冊(cè))，2004，27（4）:200-2.

[4]Palmerol,Meeonnell B,Parry D,et al.Accumulation of pl6 INK4αin mouse fibroblasts as a function of replicative senescence and not of retinoblastoma gene status[J].Oncogene,1997,15(5):495-503.

[5]Duan JM,Zhang ZY,Tong TJ.Senescence delay of human diploid fibroblast induced by anti-sense pl6 expression[J].J Biol Chem,2001,276(51):48325-31.

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[7]Wang W,Wu JF,Zhang ZY,et al.Characterization of regulatory elements on the promoter region of pl6 α that contribute to overexpression of pl6 in senescen fibroblasts[J].J Biol Chem,2001,276(52):48655-61.