王昌明 蔣 明 呂 倩 梁榮感 李運(yùn)千 (桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣西 桂林 5400)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是由氣道慢性炎癥引起的氣流受限性疾病，其發(fā)病率在全球呈明顯上升趨勢(shì)，尤其以中老年患者居多，對(duì)人類健康產(chǎn)生了嚴(yán)重的損害，已經(jīng)受到各國(guó)的重視并制定了相應(yīng)的診治指南。COPD氣流受限不完全可逆，隨著其病程的進(jìn)展，外周氣道阻塞、肺實(shí)質(zhì)破壞、肺血管的異常、長(zhǎng)期慢性缺氧發(fā)生了缺氧性肺血管收縮，肺血管內(nèi)皮功能失調(diào)和肺血管重塑等最終導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓(PAH)的發(fā)生。其中，肺血管重塑在COPD的進(jìn)展過程中起重要作用。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種具有高度特異性的細(xì)胞因子，具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂、誘發(fā)血管形成及增加血管通透性的功能〔1〕。VEGF貫穿于COPD發(fā)展的全過程中，與肺血管重塑密切相關(guān)，參與COPD并發(fā)肺動(dòng)脈高壓的形成。內(nèi)皮抑制素(Endostar)是一種特異性內(nèi)源性血管生成抑制劑，能直接作用于血管，有效地抑制新生血管的生成〔2，3〕。有研究表明，Endostar能阻止血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入DNA合成期，抑制其合成、分泌VEGF〔4〕。本文通過觀察各階段COPD大鼠模型的VEGF的表達(dá)及其與肺血管重塑的關(guān)系，了解Endostar對(duì)其的干預(yù)效果，探討Endostar對(duì)COPD肺血管重塑的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SPF級(jí)SD大鼠64只，體重(180±20)g(購(gòu)自桂林醫(yī)學(xué)院SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)。

1.1.2 藥物、試劑與儀器 脂多糖(美國(guó)Sigma公司)，香煙〔黃果樹(特醇)，貴州中煙工業(yè)公司出品，焦油含量:13 mg〕，重組人血管內(nèi)皮抑制素Endostar，中國(guó)天津麥得津公司，批號(hào):20080104，電腦小動(dòng)物呼吸機(jī)TKR-400H(南昌新長(zhǎng)征醫(yī)療科技發(fā)展有限公司)，BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)，VEGF免疫組化抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，免疫組化超敏S-P試劑盒KIT-9710(邁新生物技術(shù)開發(fā)公司)，RNA保存液(RNA LOCKER北京盛科博源生物科技有限公司)，VEGF及β-actin引物(上海生工生物工程有限公司合成)，RNAiso PLUS，、RT-PCR 試劑盒(TAKARA 大連寶生物生物工程有限公司)，大鼠VEGF ELISA檢測(cè)試劑盒(美國(guó)ADL公司)，OLYMPUS熒光倒置顯微鏡(日本)，Image-pro-plus6.0圖像分析軟件。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 COPD模型的建立和動(dòng)物分組 參照張建全等〔5〕方法建立動(dòng)物模型。SPF級(jí)雄性SD大鼠64只，隨機(jī)分為8組，每組8只，分別納入實(shí)驗(yàn)組及Endostar干預(yù)組。正常對(duì)照組(A):于第1，14天氣道內(nèi)注入生理鹽水0.2 ml，4 w后檢測(cè)。慢支組(B):于第 1，14 天氣道內(nèi)注入脂多糖(LPS，0.2 ml)200 μg/次，4 w后檢測(cè)。COPD組(C):第1，14天氣道內(nèi)注入LPS 200 μg/次，大鼠放入自制有機(jī)玻璃箱內(nèi)(0.22 m3)內(nèi)予香煙煙霧暴露，1 h/d，共4 w。COPD并低氧組:第1，14天氣道內(nèi)注入 LPS 200 μg/次，香煙煙霧暴露，1 h/d，共6 w。第5周起香煙煙霧暴露同時(shí)疊加18%低氧，每天8 h。Endostar干預(yù)組均自第3周起給予腹腔內(nèi)注射 Endostar 7.5 mg·m－2·d－1(1.25 mg/kg)。空白對(duì)照組(A1)則從第3周起腹腔注射同Endostar劑量相同的生理鹽水。

1.2.2 氣道阻力及肺血流動(dòng)力學(xué)測(cè)定及標(biāo)本采集 用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，氣管插管，接電腦小動(dòng)物呼吸機(jī)TKR-400H，工作壓力統(tǒng)一調(diào)定為6 kPa，檢測(cè)氣道阻力。暴露胸腔，把連接有壓力換能器的導(dǎo)管插入肺動(dòng)脈，通過壓力傳感器連接BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)檢測(cè)平均肺動(dòng)脈壓(mPAP)。采動(dòng)脈血予1 500 r/min離心，取上清保存于－80℃冰箱待VEGF因子檢測(cè)。取右肺下葉組織浸入4%多聚甲醛溶液中固定，行VG+維多利亞藍(lán)特殊染色觀察肺血管重塑情況，行免疫組化染色觀察VEGF表達(dá)情況。其余右肺組織放入RNA保存液(RNA LOCKER)中，于－80℃冰箱中備用，準(zhǔn)備RNA提取。

1.2.3 HE染色及維多利亞藍(lán)+VG特殊染色觀察肺組織病理改變和肺血管重塑指標(biāo) 大鼠右肺中葉組織HE染色觀測(cè)COPD大鼠模型各階段肺組織的病理改變、維多利亞藍(lán)+VG特殊染色觀察肺血管重塑指標(biāo)。采用OLYMPUS熒光倒置顯微鏡及Image-pro-plus6.0圖像分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。觀察肺血管重塑指標(biāo):400倍高倍鏡下對(duì)50 μm﹤直徑﹤100 μm的肌化性動(dòng)脈進(jìn)行圖像分析，計(jì)算血管壁厚度與血管外徑比(WT%)、血管壁面積與血管總面積比(WA%)。

1.2.4 RT-PCR檢測(cè)肺組織VEGF mRNA的表達(dá) 提取右肺組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)，以此為模板行PCR。擴(kuò)增引物:①VEGF的上游引物:5'-GGCCTCTGAAACCATGAACT-3'，下游引物:5'-ATGCTGCAGGAAGCTCATCT-3'，擴(kuò)增片段大小為385 bp。②β-actin的上游引物:5'-AGTGTGACGTGGACATCCGCAAAG-3'，下游引物:5'-ACTCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3'，擴(kuò)增片段大小為220 bp。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性 5 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸40 s，反應(yīng)35個(gè)循環(huán)，72℃延伸7 min，產(chǎn)物在2.5%的瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠數(shù)字成像系統(tǒng)掃描分析擴(kuò)增產(chǎn)物條帶，測(cè)定各擴(kuò)增條帶吸光(A)值，以VEGF與β-actin的比值作為VEGF mRNA相對(duì)含量。

1.2.5 血清VEGF水平的測(cè)定 應(yīng)用大鼠VEGF的ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)血清中的VEGF水平。操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.6 免疫組化S-P法檢測(cè)肺組織VEGF的表達(dá)水平 免疫組化步驟按S-P法試劑盒進(jìn)行。VEGF一抗血清稀釋度為1∶100。用PBS替代相應(yīng)一抗作陰性對(duì)照。VEGF陽性染色為棕黃色或棕褐色顆粒，主要定位在胞漿。免疫組化切片放大400倍，以Image-pro-plus6.0軟件分析數(shù)據(jù)，選取直徑為50～100 μm肺動(dòng)脈，分析各組肺血管免疫組化陽性細(xì)胞光密度值并進(jìn)行比較。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用±s表示，對(duì)各組數(shù)據(jù)先進(jìn)性正態(tài)檢驗(yàn)和方差齊性分析，遵循正態(tài)分布、方差齊者組間兩兩比較采用S-N-K法分析，方差不齊者采用Games-Howell法。同一實(shí)驗(yàn)組與藥物干預(yù)組間采用配對(duì)檢驗(yàn)。將實(shí)驗(yàn)大鼠血清VEGF濃度、肺組織VEGF mRNA表達(dá)及肺組織免疫組化的VEGF表達(dá)量分別與肺血管重塑指標(biāo)WT%、WA%進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 氣道阻力變化 相同工作壓力下(6 Kpa)，大鼠氣道阻力指標(biāo)A、B組無明顯變化(P＞0.05)，C、D組氣道阻力較A組增加，且B、C、D組氣道阻力依次遞增，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。各藥物干預(yù)組與各自對(duì)應(yīng)的試驗(yàn)組比較C1組較C組、D1組較D組氣道阻力降低(P＜0.05)。見表1。

2.2 肺血流動(dòng)力學(xué) 平均肺動(dòng)脈壓(mPAP)指標(biāo)，與A組相比，B組與A組無明顯差異(P＞0.05)，而C、D組mPAP較A組明顯增高(P＜0.01)。各藥物干預(yù)組與各自對(duì)應(yīng)的試驗(yàn)組比較，可見C1組較C組，D1組較D組mPAP降低(P＜0.05)。見表1。

2.3 肺組織病理改變及肺血管重塑指標(biāo) 大鼠肺組織HE染色顯示，A組氣道結(jié)構(gòu)正常，管壁完整，無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。B組氣道壁結(jié)構(gòu)基本完整，有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。C組可見氣道上皮黏液杯狀細(xì)胞增生，部分肺大泡形成，氣道管壁可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。D組氣道黏膜充血水腫，黏液杯狀細(xì)胞及氣道平滑肌增生明顯，小血管肌化明顯。氣道管壁炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)加重。說明B、C、D組病理表現(xiàn)符合慢支、COPD、COPD并低氧的病理改變。A1組、B1組與對(duì)應(yīng)的A、B組相比，差異不明顯。C1組與C組相比炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，肺大泡情況有改善。D1組比D組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，氣道平滑肌斷裂、小血管肌化等有所改善。

維多利亞藍(lán)+VG特殊染色分析血管重塑指標(biāo)，與A組相比，B組肺血管重塑指標(biāo)WT%、WA%無明顯變化(P＞0.05)，C、D組WT%、WA%比A組明顯增高(P＜0.05)。與D組相比，B、C兩組WT%比 D組降低，B組WA%比D組降低(P＜0.05)。C1組較C組，D1組較D組的WT%、WA%降低(P＜0.05)。而A1、B1組WT%、WA%與對(duì)應(yīng)的試驗(yàn)組A、B組比較無明顯差異(P＞0.05)。見表2。

2.4 肺組織內(nèi)VEGF mRNA的表達(dá) 與A組相比，B、C、D三組VEGF mRNA表達(dá)增強(qiáng)(P＜0.05)。D組VEGF mRNA表達(dá)強(qiáng)于B組(P＜0.05)。各藥物干預(yù)組與各自對(duì)應(yīng)的試驗(yàn)組比較，VEGF mRNA表達(dá) A組與 A1組相比無明顯差異(P＞0.05)，B1組較B組，C1組較 C組，D1組較 D組肺組織內(nèi)VEGF mRNA表達(dá)降低(P＜0.05)。說明 B、C、D組 VEGF mRNA表達(dá)逐漸增強(qiáng)，藥物抑制后，此三組的VEGF mRNA表達(dá)減弱。見表3，圖1。

表1 各組氣道阻力及平均肺動(dòng)脈壓的比較 ± s，n=8)

表1 各組氣道阻力及平均肺動(dòng)脈壓的比較 ± s，n=8)

與A組比較:1)P＜0.05;與D組比較:2)P＜0.05;與各自對(duì)應(yīng)實(shí)驗(yàn)組比較:3)P＜0.05，下表同

組別 氣道阻力(kPa)mPAP A組0.37±0.05 22.07±1.85 B組 0.39±0.042) 24.51±2.602)C組 0.51±0.041)2) 29.65±3.631)D組 0.61±0.071) 34.61±5.801)A1組 0.37±0.05 22.55±2.10 B1組 0.35±0.03 23.73±4.53 C1組 0.46±0.043) 23.99±3.823)D1組 0.51±0.083) 24.68±4.043)

表2 肺血管重塑指標(biāo)分析(± s，n=8)

表2 肺血管重塑指標(biāo)分析(± s，n=8)

組別WT% WA%A組13.36±1.33 44.90±4.21 B組 15.37±2.072) 49.70±5.101)C組 17.21±2.361)2) 56.92±6.631)D組 20.62±1.581) 61.57±5.891)A1組 12.66±1.80 44.25±3.75 B1組 13.13±1.43 47.84±2.12 C1組 14.06±2.283) 49.14±2.453)D1組 16.18±1.563) 52.76±4.463)

2.5 血清中VEGF的測(cè)定 分析不同組血清中VEGF濃度的變化，可見血清中血清中D組濃度明顯高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);各藥物干預(yù)組與各自對(duì)應(yīng)的試驗(yàn)組比較，可見B1組較B組，C1組較C組，D1組較D組血清中VEGF濃度降低(P＜0.05)。見表3。

2.6 肺血管VEGF免疫組化結(jié)果 免疫組化顯示VEGF陽性表達(dá)在氣道上皮及肺血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿，呈棕黃色。與A組比較，C、D組 VEGF表達(dá)增高(P＜0.05)，而 A、B組間以及 C、D組之間表達(dá)無差異。各藥物干預(yù)組與各自對(duì)應(yīng)的試驗(yàn)組比較，肺血管免疫組化VEGF表達(dá)A組與A1，B組與B1組相比無明顯差異(P＞0.05)，C1組較C組，D1組較D組肺血管內(nèi)皮的VEGF表達(dá)下降(P＜0.05)。提示COPD組及COPD并低氧組的VEGF表達(dá)顯著高于正常組，藥物干預(yù)后此兩組VEGF表達(dá)下調(diào)。見表3，圖2。

2.7 肺組織VEGF表達(dá)與肺血管重塑的相關(guān)性分析 將實(shí)驗(yàn)大鼠血清VEGF濃度、肺組織VEGF mRNA表達(dá)及肺組織免疫組化的VEGF表達(dá)量分別與肺血管重塑指標(biāo)WT%、WA%進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)血清 VEGF濃度和肺小動(dòng)脈的WT%、WA%呈正相關(guān)(血清VEGF濃度與WT%的相關(guān)系數(shù)r=0.780，血清 VEGF濃度與 WA%的相關(guān)系數(shù) r=0.711，均P＜0.05);肺組織VEGF mRNA表達(dá)和肺小動(dòng)脈的WT%、WA%呈正相關(guān)(VEGF mRNA表達(dá)與WT%的相關(guān)系數(shù)r=0.833，VEGF mRNA表達(dá)與WA%的相關(guān)系數(shù)r=0.729，均P＜0.05);VEGF表達(dá)量和肺小動(dòng)脈的 WT%、WA%呈正相關(guān)(VEGF表達(dá)量與WT%的相關(guān)系數(shù)r=0.975，VEGF表達(dá)量與WA%的相關(guān)系數(shù)r=0.982，均P＜0.05)。

圖1 各組VEGF mRNA表達(dá)情況

表3 各組VEGF mRNA的表達(dá)情況、血清中VEGF濃度(ng/ml)及免疫組化VEGF在各組肺血管表達(dá)光密度值比較

圖2 肺組織VEGF表達(dá)情況(免疫組化染色，×400)

3 討論

多種因素如吸煙、低氧、炎性因子等均可刺激VEGF的分泌〔6〕。肺血管重塑在COPD并發(fā)的肺動(dòng)脈高壓的形成、發(fā)展和維持中起重要作用。VEGF可通過激活血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)的活性氧(ROS)信號(hào)及 NF-κB轉(zhuǎn)錄致使血管平滑肌遷移，說明VEGF表達(dá)增加與肺動(dòng)脈重塑有關(guān)〔7〕。Santos等〔8〕發(fā)現(xiàn) COPD患者肺動(dòng)VEGF的表達(dá)與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)，在無明顯缺氧的COPD早期VEGF表達(dá)增加，可能是內(nèi)皮功能紊亂、血管重建中的一個(gè)重要的因子。Kranenburg等〔9〕發(fā)現(xiàn)COPD患者細(xì)支氣管、肺泡上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞及氣道平滑肌細(xì)胞VEGF及其受體表達(dá)明顯增加，同時(shí)說明VEGF及其受體不僅與COPD的血管重塑有關(guān)，也與COPD氣道重建、氣流受限的形成有關(guān)。Endostar能特異地作用于內(nèi)皮細(xì)胞，尤其是微血管的內(nèi)皮細(xì)胞，控制新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，抑制其遷移，從而抑制血管生成和腫瘤生長(zhǎng)〔10〕。目前在臨床已用于多種腫瘤的治療，具有較好的療效和安全性〔2，3〕。Kim〔11〕等報(bào)道內(nèi)皮抑素通過結(jié)合 VEGF 受體KDR/Flk-1細(xì)胞膜外的結(jié)構(gòu)域，阻斷VEGF誘導(dǎo)的KDR/Flt-1受體型酪氨酸激酶活化和下游事件，后者包括激活ERK、MAPK和FAK，從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷徙作用。伍尚敏〔4〕等研究發(fā)現(xiàn)，Endostar作用前血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF cDNA表達(dá)量明顯高于Endostar作用后的表達(dá)量，Endostar能阻止血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入DNA合成期，抑制其合成、分泌VEGF〔4〕。

本結(jié)果COPD疾病過程中，隨著病程進(jìn)展，VEGF表達(dá)逐漸上調(diào)，與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)，給予Endostar干預(yù)后，疾病嚴(yán)重程度相關(guān)指標(biāo)下降，提示Endostar可能通過拮抗內(nèi)源性VEGF的產(chǎn)生來抑制微血管重塑，達(dá)到減緩COPD病程進(jìn)展的目的。

1 Ferrara N，Gerber HP，LeCouter J.The biology of VEGF and its receptors〔J〕.Nat Med，2003;9:669-76.

2 Mendoza L，Valcarcel M，Carrascal T，et al.Inhibition of cytokine-induced microvascular arrest of tumor cells by recombinant endostatin prevents experimental hepatic melanoma metastasis〔J〕.CancerRes，2004;64(1):304-10.

3 te Velde EA，Reijerkerk A，Brandsma D，et al.Early endostatin treatment inhibits metastatic seeding of murine colorectal cancer cells in the liver and their adhension to endostatin cells〔J〕.Br J Cancer，2005;92(4):729-35.

4 伍尚敏，趙亞南，楊 力，等.重組人血管內(nèi)皮抑制素對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用〔J〕.中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2008;17(5):685-8.

5 張建全，鐘小寧，蔣 明，等.慢性支氣管炎、肺氣腫時(shí)肺動(dòng)脈高壓與肺血管壁改建與炎癥的關(guān)系〔J〕.中國(guó)病理生理雜志，2006;22(9):1811-5.

6 Voelkel NF，Cool C，Taraceviene-Stewart L，et al.Janus face of vascular endothelial growth factor:the obligatory survival factor for lung vascular endothelium controls precapillary artery remodeling in severe pulmonary hypertension〔J〕.Crit Care Med，2002;30:251-6.

7 Ma L，Tessier-Lavigne M.Dual branch-promoting and branch-repelling actions of Slit/Robo signaling on peripheral and central branches of developing sensory axons〔J〕.Neurosci，2007;27(25):6843-51.

8 Santos S，Victor I，Peinado VI，et al.Enhanced expression of vascular endothelial growth factor in pulmonary arteries of smokers and patients with moderate chronic obstructive pulmonary disease〔J〕.Am J Respir Crit Care Med，2003;167(9):1250-6.

9 Kranenburg AR，de Boer WI，Alagappan VKT，et al.Enhanced bronchial expression of vascular endothelial growth factor and receptors(Flk-1and Flt-1)in patients with chronic obstructive pulmonary disease〔J〕.Thorax，2005;59(2):106-13.

10 Jia YH，Dong XS，Wang XS.Effects of endostatin on expression of vascular endothelial growth factor and its receptors and neovascularization in colonic carcinoma implanted in nude mice〔J〕.World J Gastroenterol，2004;10(22):3361-4.

11 Kim YM，Hwang S，Pym BJ，et al.Endostatin blocks vascular endothelial growth factor-mediated signaling via direct interaction with KDR/Flk-l〔J〕.J Biol Chem，2002;277(31):27872-9.