王曉梅 李正紅 夏滿莉 胡 杰 姜翠榮 高 琴 (蚌埠醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，安徽 蚌埠 233030)

硝酸甘油(nitroglycerin，GTN)在臨床應(yīng)用非常廣泛，尤其是治療心肌缺血相關(guān)疾病，如穩(wěn)定性、不穩(wěn)定性心絞痛、急性心肌梗死等效果顯著，但在治療慢性心肌缺血方面效果不明確，且長(zhǎng)期使用GTN其抗心肌缺血及擴(kuò)血管效應(yīng)降低或消失，存在“耐受現(xiàn)象”〔1〕。Chen等〔2〕發(fā)現(xiàn)線粒體乙醛脫氫酶2(acetaldehyde dehydrogenase 2，ALDH2)作為一種重要的線粒體氧化還原酶參與硝酸鹽類生物活化，提示硝酸鹽類耐受可能與ALDH2活性被抑制有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)室在離體大鼠心肌缺血/再灌注損傷模型上觀察不同濃度GTN對(duì)心肌損傷的作用，進(jìn)一步分析其機(jī)制是否與ALDH2的釋放有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和材料 健康雄性 Sprague-Dawley(SD)大鼠體重，200～250 g，清潔級(jí)，40只，由蚌埠醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。GTN注射液為北京益民藥業(yè)有限公司產(chǎn)品?？俁NA提取試劑Trizol購(gòu)自Invitrogen公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自Fermentas公司;焦碳酸二乙酯(DEPC)購(gòu)自上海生工生物工程有限公司;瓊脂糖、溴化乙錠(EB)、溴酚蘭購(gòu)自上海生工生物工程有限公司;其余為國(guó)產(chǎn)分析純。改良 Krebs-Henseleit(K-H) 液成分:NaCl 118 mmol/L，KCl 4.7 mmol/L，KH2PO41.2 mmol/L，MgSO41.2 mmol/L，CaCl22.5 mmol/L，NaHCO325 mmol/L，Glucose 11 mmol/L，pH 7.3 ～7.4。ALDH2和β-actin引物由上海生工生物工程有限公司合成。目的基因ALDH2上游引物為5'-GTG TTC GGA GAC GTC AAA GA-3'，下游引物為5'-GCA GAG CTT GGG ACA GGT AA-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度187 bp;內(nèi)參β-actin上游引物為5'-GAT GGT GGG TAT GGG TCA GAA GGA C-3'，下游引物為5'-GCT CAT TGC CGA TAG TGA TGA CT-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度630 bp。

1.2 方法

1.2.1 大鼠心肌缺血/再灌注損傷模型復(fù)制及分組 雄性SD大鼠斷頭后開(kāi)胸，迅速取出心臟，置于4℃ 改良K-H液中，固定于Langendorff灌流裝置，K-H液常規(guī)恒壓(76 mmHg)灌流，以95%O2+5%CO2飽和，維持灌流液溫度37℃。將充水乳膠囊由切開(kāi)的左心耳處插入至左心室，囊內(nèi)壓力經(jīng)特氟綸管傳遞至壓力傳感器，由MedLab生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)記錄和分析。各組心臟均穩(wěn)定20 min后，局部結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支模擬缺血30 min，松開(kāi)結(jié)扎線復(fù)灌30 min。藥物干預(yù)組于缺血25 min時(shí)給予不同濃度的GTN灌流至復(fù)灌初期10 min，灌流共15 min。大鼠隨機(jī)分為5組，每組8只，各組樣本來(lái)自同一批動(dòng)物。(1)正常對(duì)照組，大鼠離體心臟K-H液灌流80 min;(2)單純?nèi)毖?再灌注(I/R)組;(3)低濃度GTN組:GTN濃度為1×10－8mol/L;(4)中濃度GTN組:灌流GTN濃度為1×10－7mol/L;(5)高濃度 GTN組:灌流 GTN的濃度為2×10－6mol/L。

1.2.2 左心室功能評(píng)價(jià) 向插入左心室內(nèi)的乳膠囊注水使左心室舒張末壓(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)維持于4～8 mmHg，記錄室內(nèi)壓曲線，測(cè)量左心室發(fā)展壓(Left ventricular developed pressure，LVDP)、室內(nèi)壓最大上升/下降速率(maximal rise/fall rate of left ventricular pressure，dp/dtmax)、LVEDP等心功能指標(biāo)。

1.2.3 RT-PCR方法檢測(cè)ALDH2 mRNA表達(dá) 采用 Trizol一步法提取左心室心尖部組織總RNA，取總 RNA 3 μg為模板，用隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，以此 cDNA 1.5 μl為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性3 min后，以95℃ 50 s變性，β-actin退火溫度53.4℃ 50 s;ALDH2退火溫度59.8℃50 s;72℃ 60 s，反應(yīng)30個(gè)循環(huán)，最后一輪延伸10 min。PCR產(chǎn)物判定:取4 μl PCR產(chǎn)物用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠(EB)顯色，結(jié)果在GIS凝膠圖像處理系統(tǒng)中拍攝記錄，使用圖像分析軟件對(duì)泳帶進(jìn)行光密度掃描作半定量分析，以目的基因與內(nèi)參對(duì)照的積分吸光度比值(ALDH2/β-actin)表示mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，結(jié)果以±s表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析和Newman-Keuls法分析。

2 結(jié)果

2.1 左心室血流動(dòng)力學(xué)變化 離體心臟復(fù)灌30 min末觀察不同組別血流動(dòng)力學(xué)變化。與I/R組比較，低濃度GTN組LVDP增高，±dp/dtmax增高，LVEDP降低;中濃度GTN組各項(xiàng)指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;高濃度GTN組LVDP和±dp/dtmax降低，LVEDP增高。見(jiàn)表1。

表1 不同組別再灌注30 min末心室動(dòng)力學(xué)指標(biāo)改變( ± s，n=8)

表1 不同組別再灌注30 min末心室動(dòng)力學(xué)指標(biāo)改變( ± s，n=8)

與I/R組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;下表同

組別 LVDP(mmHg) +dp/dtmax(mmHg/s) -dp/dtmax(mmHg/s) LVEDP(mmHg)I/R組40.5±3.6 1 095.9±204.2 －643.2±56.3 12.4±1.5 10－8mol/L GTN組 72.7±5.62) 2 404.2±384.62) －1 047.3±177.72) 4.9±0.91)10－7mol/L GTN組 47.2±10.9 1 122.4±168.6 －730.2±160.5 18.3±6.5 2×10－6mol/L GTN組 29.1±5.41) 781.3±87.31) －530.9±79.41) 35.8±8.12)

2.2 冠狀動(dòng)脈流出液中LDH含量 與I/R組相比，高濃度GTN組冠脈流出液中LDH釋放增加;中濃度GTN組LDH釋放相差不大;低濃度GTN組LDH釋放減少。見(jiàn)表2。

2.3 心肌ALDH2基因表達(dá)的變化 與正常對(duì)照組(2.64±0.08)相比，高、中濃度 GTN組(0.89±0.23，1.78±0.11)及 I/R組(1.94±0.06)大鼠心肌ALDH2 mRNA的表達(dá)顯著降低(P＜0.01);低濃度GTN組(2.77±0.09)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。與I/R組比較，低濃度GTN組心肌ALDH2 mRNA表達(dá)均顯著升高;高濃度GTN組ALDH2 mRNA表達(dá)下降(P＜0.01)。見(jiàn)圖1。

表2 離體心臟缺血/再灌注不同時(shí)間點(diǎn)冠狀動(dòng)脈流出液中LDH的變化( ± s，n=8)

表2 離體心臟缺血/再灌注不同時(shí)間點(diǎn)冠狀動(dòng)脈流出液中LDH的變化( ± s，n=8)

組別 再灌注5 min 再灌注10 min I/R組46.67±4.02 50.67±7.75 10－8mol/L GTN組 18.75±8.542) 22.19±7.592)10－7mol/L GTN組 40.89±5.67 45.68±5.32 2×10－6mol/L GTN組 79.17±6.292) 72.50±5.792)

圖1 復(fù)灌30 min后各組ALDH2 mRNA表達(dá)RT-PCR電泳圖

3 討論

GTN是硝酸酯類擴(kuò)張血管藥物的基礎(chǔ)藥物，自1876年首次應(yīng)用于臨床，至今已有130多年的歷史。GTN可擴(kuò)張容量血管及阻力血管，選擇性擴(kuò)張心外膜層血管及狹窄的冠狀血管以及側(cè)支血管，被廣泛應(yīng)用于治療慢性心功能不全、室性心肌梗死、心絞痛及高血壓等多種疾病與危象。Mackenzie等〔3〕在人體內(nèi)運(yùn)用ALDH2抑制劑雙硫侖證實(shí)抑制ALDH2可部分抑制GTN在人體內(nèi)的擴(kuò)血管作用;對(duì)ALDH2－/-基因敲除小鼠的研究也表明ALDH2在GTN治療劑量下的擴(kuò)張血管中起著重要的和必要的作用〔4〕。不同濃度GTN對(duì)心肌缺血/再灌注損傷產(chǎn)生不同的生物學(xué)效應(yīng)。GTN有多種代謝途徑，失活或激活亦引發(fā)不同的生物學(xué)效應(yīng)。失活途徑產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物包括無(wú)機(jī)的亞硝酸鹽、硝酸鹽以及1，3-二硝酸酯丙三醇(即1，3-GDN)，主要是通過(guò)谷胱甘肽還原酶(即GR)和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(即GSD)催化完成〔5〕。激活途徑的代謝產(chǎn)物包括NO、S-亞硝基硫醇、無(wú)機(jī)亞硝酸鹽及 1，2-二硝酸酯丙三醇(即 1，2-GDN)〔6〕。有研究表明，線粒體內(nèi)ALDH2是GTN生物活化時(shí)的關(guān)鍵酶之一〔7〕。GTN在線粒體中經(jīng)過(guò)ALDH2催化，生成NO或NO相關(guān)的中間產(chǎn)物(NOx)、S-亞硝基硫醇、無(wú)機(jī)亞硝酸鹽和1，2-二硝基甘油等物質(zhì)，其中NOx或S-亞硝基硫醇可能作為活性中間介質(zhì)激活可溶性鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶 (soluble guanyly l cyclase，sGC)，促使組織中的第二信使環(huán)鳥(niǎo)苷酸(cGMP)增多。cGMP激活cGMP依賴蛋白，通過(guò)調(diào)節(jié)胞內(nèi)Ca2+水平調(diào)節(jié)磷酸化蛋白使血管舒張。ALDH2還可對(duì)GTN產(chǎn)生直接的催化作用，水解GTN生成l，2-GDN和NO2，NO2繼而進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為NO，發(fā)揮舒血管作用。GTN依賴ALDH2激活 cGMP反應(yīng)〔8〕，如果 ALDH2受到抑制，GTN的血管擴(kuò)張作用就受到抑制。Chen等〔2〕對(duì)在體和離體動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，觀察到抑制ALDH2和敲除ALDH2均減少GTN的活性，提示線粒體ALDH2可激活低濃度GTN(此時(shí)GTN濃度為0.1～10×10－6mol/L)活性而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。GTN耐受性與血管中ALDH2的活性受阻、GTN代謝下降及線粒體產(chǎn)生ROS增多等有關(guān)〔9〕。Wenzel報(bào)道ALDH2生物激活關(guān)鍵是依賴于使用硝基血管擴(kuò)張劑藥物數(shù)量的多少〔10〕。GTN在1～10×10－6mol/L濃度范圍內(nèi)增加導(dǎo)致 1，2-GDN/1，3-GDN 比率逐漸減小，此比率代表著GTN抑制ALDH2轉(zhuǎn)化效率。GTN濃度越大，比率越小(從8降到1)，對(duì)ALDH2的抑制作用越強(qiáng)〔8〕。文獻(xiàn)報(bào)道1×10－6mol/L的GTN對(duì)ALDH2的抑制作用相當(dāng)于ALDH2的抑制劑50×10－6mol/L benomyl或daidzin的作用;均顯著降低1，2-GDN/1，3-GDN 比率大約到1〔7〕。大劑量 GTN 同時(shí)增加線粒體中活性氧(reactive oxygen species，ROS)的釋放，ROS進(jìn)一步抑制ALDH2的活性，最終表現(xiàn)為大劑量GTN抑制ALDH2的活性〔8〕。本實(shí)驗(yàn)在離體大鼠心臟上觀察到低濃度的GTN(10－8mol/L)對(duì)缺血/再灌注心肌有保護(hù)作用，該作用機(jī)制可能與低濃度GTN增加ALDH2表達(dá)有關(guān);高濃度GTN(10－6mol/L)抑制ALDH2的活性，加重了心臟的損傷作用。不同濃度GTN對(duì)離體大鼠心肌損傷產(chǎn)生不同生物學(xué)效應(yīng)，與ALDH2釋放量多少密切相關(guān)，其臨床效果是否與ALDH2活性有關(guān)還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

1 Elkayam U，Kulick D，McIntosh N，et al.Incidence of early tolerance to hemodynamic effects of continuous infusion of nitroglycerin in patients with coronary artery disease and heart failure〔J〕.Circulation，1987;76(3):577-84.

2 Chen Z，Zhang J，Stamler JS.Identification of the enzymatic mechanism of nitroglycerin bioactivation〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2002;99(12):8306-11.

3 Mackenzie IS，Maki-Petaja KM，McEniery CM，et al.Aldehyde dehydrogenase 2 plays a role in the bioactivation of nitroglycerin in humans〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2005;25(9):1891-5.

4 Chen Z，F(xiàn)oster MW，Zhang J，et al.An essential role for mitoehondrial aldehyde dehydrogenasein nitroglycerin bioactivation〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2005;102(34):12159-64.

5 Kurz MA，Boyer TD，Whalen R，et al.Nitroglycerin metabolism in vascular tissue:role of glutathione S-transferases and relationship between NO and NO2-formation〔J〕.Biochemistry，1993;292(pt2):545-50.

6 Fung HL.Biochemical mechanism of nitroglycerin action and tolerance:is this old mystery solved〔J〕?Annu Rev Pharmacol Toxicol，2004;44:67-85.

7 Chen Z，Stamler JS.Bioactivation of nitroglycerin by the mitochondrial aldehyde dehydrogenase〔J〕.Trends Cardiovasc Med，2006;16(8):259-65.

8 Daiber A，Oelze M，Coldewey M，et al.Oxidative stress and mirochondrial aldehyde dehydrogenase activity:a comparison of pentaerythritol tetranitrate with other organic nitrates〔J〕.Mol Pharmacol，2004;66(6):1372-82.

9 Sydow K，Daiber A，Oelze M，et al.Central role of mitochondrial aldehyde dehydrogenase and reactive oxygen species in nitoglycerin tolerance and cross-tolerance〔J〕.Clin Invest，2004;113(3):482-9.

10 Wenzel P，Hink U，Oelze M，et al.Number of nitrate groups determines reactivity and potency of organic nitrates:a proof of concept study in ALDH-2－/-mice〔J〕.Br Pharmacol，2007;150(4):526-33.