張殿君 譚 巖 付長峰 張利恒 (吉林大學(xué)第一醫(yī)院，吉林 長春 3002)

少突膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘形成細(xì)胞，與多發(fā)性硬化、腦白質(zhì)發(fā)育不良及腦脊髓損傷等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病關(guān)系密切。但體外誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)分化研究表明，NSCs雖然具有多分化潛能，但在自然分化狀態(tài)下分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞的潛能最大，少突膠質(zhì)細(xì)胞所占比例最少〔1〕。因此，如能使用一定方法使NSCs定向分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞，可為中樞神經(jīng)的損傷修復(fù)提供更多的種子細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)胰島素樣生長因子-1(IGF-1)對于神經(jīng)細(xì)胞正常生長、發(fā)育的調(diào)節(jié)具有重要作用，可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的突觸形成、樹突快速生長及髓鞘生成;可以影響不同類型神經(jīng)細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞的生存能力，提高神經(jīng)細(xì)胞的分化和發(fā)育;可以促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞以及髓鞘的生長，并能促進(jìn)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)脫髓鞘后的髓鞘再生〔2～5〕。因此，本研究擬探討IGF-1誘導(dǎo)脊髓源性NSCs向少突膠質(zhì)細(xì)胞方向分化的機制，為探索治療脊髓損傷的新方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基，B27添加劑，胎牛血清，購自Gibco公司;脂質(zhì)體2000、抗磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)1/2抗體，購自Invitrogen公司;RT-PCR試劑盒，購自TAKARA公司;ERK特異性抑制劑PD98059，購自Promega公司;新生24 h內(nèi)的Wistar大鼠(SPF級)，由吉林大學(xué)動物室提供;重組載體pcDNA3.1-GFP-IGF由本實驗室自行構(gòu)建并保存。

1.2 方法

1.2.1 NSCs的分離 新生Wistar大鼠斷頸處死后，無菌條件下取出脊柱，機械法分離細(xì)胞，用神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)液〔DMEM/F12為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，B27添加劑終濃度為1%，堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)和重組人表皮生長因子(EGF)終濃度均為20 ng/ml〕調(diào)節(jié)細(xì)胞終濃度為2×105，接種到10 cm平皿，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中增殖培養(yǎng)。

1.2.2 轉(zhuǎn)染IGF-1基因脊髓源性NSCs的建立 傳代培養(yǎng)細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，貼壁細(xì)胞達(dá)60% ～70%時，常規(guī)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1-GFP-IGF-1。轉(zhuǎn)染后48 h，將細(xì)胞消化傳代至10 cm平皿中，用含G418(600 μg/ml)的DF完全培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，含300 μg/ml G418的完全培養(yǎng)基維持培養(yǎng)。

1.2.3 IGF-1對NSCs ERK1/2蛋白磷酸化的影響 在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)，以細(xì)胞開始表達(dá)時間點為0 h，按照0 h、0.5 h、1 h、2 h、4 h 時間點提取細(xì)胞蛋白質(zhì)。Western印跡檢測磷酸化ERK1/2蛋白表達(dá)，具體步驟如下:各時間點提取蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯凝膠電泳(SDS-PAGE)并轉(zhuǎn)印到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，依次加入抗磷酸化ERK1/2抗體和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗，最后以二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。

1.2.4 ERK1/2特異性抑制劑PD98059對ERK1/2磷酸化的影響 將終濃度為0、5、10、20、40 μmol/L 的 ERK1/2 特異性抑制劑PD98059分別加入培養(yǎng)板中，與細(xì)胞共培養(yǎng)2 h，提取細(xì)胞蛋白質(zhì)，利用Western印跡法檢測ERK磷酸化的改變。方法同1.2.3。

1.2.5 IGF-1對轉(zhuǎn)錄因子c-fos、c-jun和c-myc表達(dá)的影響 以細(xì)胞開始表達(dá)IGF-1 時間點為0 h，按照0 h、0.5 h、1 h、2 h 時間點提取細(xì)胞RNA，并利用RT-PCR檢測轉(zhuǎn)錄因子c-fos、c-jun和c-myc的表達(dá)。

1.2.6 ERK1/2特異性抑制劑 PD98059對轉(zhuǎn)錄因子c-fos、c-jun表達(dá)的影響 當(dāng)細(xì)胞開始表達(dá)IGF-1時，向培養(yǎng)液中加入20 μmol/L 的 PD98059，共培養(yǎng) 1 h，提取細(xì)胞 RNA，利用 RTPCR檢測轉(zhuǎn)錄因子c-fos、c-jun的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 IGF-1對處于分化狀態(tài)的NSCs ERK1/2磷酸化的影響 將IGF-1開始表達(dá)后的分化 NSCs，應(yīng)用 Western印跡檢測ERK1/2蛋白的磷酸化情況。隨著時間的增加，NSCs中磷酸化的ERK1/2表達(dá)逐漸增高，2 h的時候增加最多，隨后表達(dá)下降。見圖1。

2.2 ERK1/2特異性抑制劑PD98059對ERK1/2磷酸化的影響 將終濃度為 0、5、10、20、40 μmol/L 的 ERK1/2 特異性抑制劑PD98059分別加入培養(yǎng)板中和細(xì)胞共培養(yǎng)2 h，提取細(xì)胞蛋白質(zhì)，利用Western印跡檢測ERK磷酸化的改變。PD98059抑制ERK磷酸化的程度隨著濃度的增加而增加，但濃度增加到20 μmol/L之后，再增加濃度抑制作用也不再增強。見圖2。

圖1 不同時間段IGF-1對ERK磷酸化的影響

圖2 ERK1/2特異性抑制劑PD98059對ERK1/2磷酸化的影響

2.3 RT-PCR檢測轉(zhuǎn)錄因子c-fos、c-jun和c-myc的表達(dá) 應(yīng)用RT-PCR檢測IGF-1開始表達(dá)后0 h、0.5 h、1 h和2 h時即早轉(zhuǎn)錄因子c-fos、c-jun和c-myc基因在NSCs中的表達(dá)，結(jié)果表明c-fos、c-jun mRNA表達(dá)水平在0.5 h和1 h時開始明顯增加，而c-myc mRNA水平在各時間點無明顯差別。見圖3。

圖3 IGF-1對NSCs的即早基因c-fos、c-jun、c-myc轉(zhuǎn)錄的影響

圖4 ERK1/2特異性抑制劑PD98059對IGF-1誘導(dǎo)即早基因c-fos、c-jun轉(zhuǎn)錄的影響

2.4 ERK1/2特異性抑制劑PD98059對轉(zhuǎn)錄因子c-fos、c-jun表達(dá)的影響 應(yīng)用RT-PCR檢測IGF-1開始表達(dá)后，ERK1/2特異性抑制劑PD98059對轉(zhuǎn)錄因子c-fos、c-jun表達(dá)的影響。結(jié)果表明ERK1/2抑制劑PD98059可顯著抑制IGF-1誘導(dǎo)的c-fos和c-jun mRNA表達(dá)。見圖4。

3 討論

近年的研究表明，少突膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘形成細(xì)胞。髓鞘使神經(jīng)元的軸突產(chǎn)生電絕緣，有利于神經(jīng)元之間電信號的傳導(dǎo)，少突膠質(zhì)細(xì)胞和髓鞘的損傷必然導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)相應(yīng)疾病，而少突膠質(zhì)細(xì)胞移植到髓鞘缺陷或損傷的動物體內(nèi)可形成新的髓鞘并促進(jìn)軸突再生。因此，少突膠質(zhì)細(xì)胞移植有望用來治療脊髓損傷導(dǎo)致的脫髓鞘等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。在前期實驗研究中，已經(jīng)證實了轉(zhuǎn)染了IGF-1的NSCs可以分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞。由于ERK在細(xì)胞增殖、分化和存活中起重要調(diào)節(jié)作用〔6，7〕，本研究在誘導(dǎo)NSCs向少突膠質(zhì)細(xì)胞分化的基礎(chǔ)上，探討了MEK、ERK及下游轉(zhuǎn)錄因子c-fos和c-jun等在IGF-1誘導(dǎo)NSCs向少突膠質(zhì)細(xì)胞分化中的作用。

本實驗應(yīng)用Western印跡檢測了IGF-1開始表達(dá)后的分化NSCs中ERK1/2蛋白磷酸化情況。結(jié)果可見，隨著時間的增加，NSCs中磷酸化的ERK1/2表達(dá)逐漸增高;而ERK1/2特異性抑制劑PD98059可顯著抑制ERK的磷酸化程度，表明在IGF-1表達(dá)開始后，影響生長、分化、增殖的信號與ERK信號傳導(dǎo)通路有關(guān)聯(lián)，NSCs向少突膠質(zhì)細(xì)胞分化的過程需要ERK1/2信號途徑的活化。

應(yīng)用RT-PCR檢測IGF-1開始表達(dá)后，ERK1/2特異性抑制劑PD98059對轉(zhuǎn)錄因子 c-fos、c-jun表達(dá)的影響。結(jié)果表明ERK1/2抑制劑 PD98059可顯著抑制 IGF-1誘導(dǎo)的c-fos和c-jun mRNA表達(dá)。這些結(jié)果和前面ERK磷酸化的結(jié)果相結(jié)合，可以得出以下推論，NSCs轉(zhuǎn)染IGF-1并開始表達(dá)IGF-1之后，IGF-1啟動了ERK信號途徑，隨后將信號傳遞給即早基因c-fos、c-jun，然后 c-fos、c-jun 開始表達(dá)，最終導(dǎo)致了 NSCs分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞。

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