白利民 申 強(qiáng) (吉林省人民醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130021)

條件復(fù)制型腺病毒又稱腫瘤特異性增殖型腺病毒，目前最廣泛地應(yīng)用于腫瘤的基因治療。腫瘤與正常細(xì)胞組織因基因結(jié)構(gòu)上的差異，出現(xiàn)了包括代謝、增生、生長(zhǎng)等多方面的明顯差異。腫瘤細(xì)胞復(fù)制過(guò)程中可以大量分泌出正常細(xì)胞無(wú)法分泌或者少分泌的物質(zhì)，條件復(fù)制型腺病毒可以利用這些物質(zhì)對(duì)病毒產(chǎn)生特異的靶向性，可在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增生，達(dá)到目的基因蛋白表達(dá)，最終殺死腫瘤細(xì)胞。鑒于良好的啟動(dòng)活性和腫瘤特異性，Cox-2等啟動(dòng)子越來(lái)越成為基因治療中研究的熱點(diǎn)與重點(diǎn)〔1～7〕，并已構(gòu)建Cox-2啟動(dòng)子攜帶E1A的條件復(fù)制性腺病毒 (Ad-Cox-2-E1A)〔8〕。本文通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因原理，檢測(cè)Cox-2啟動(dòng)子在實(shí)驗(yàn)細(xì)胞中的啟動(dòng)活性。

1 材料與方法

1.1 材料 熒光素酶檢測(cè)試劑，RNeasy Mini kit，RNase inhibitor，Adeno-XTM Expression System，MTT 試劑盒，病毒基因組提取試劑盒，RNA提取試劑盒，DMEM medium，HEK293細(xì)胞組，anti-Cox-2抗體，anti-E1A抗體，Western印跡試劑等。

1.2 方法

1.2.1 重組條件復(fù)制性腺病毒的獲得

1.2.1.1 重組腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 本實(shí)驗(yàn)所用的腺病毒載體為人血清5型腺病毒，重組腺病毒質(zhì)粒Ad-Cox-2-E1A經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定。PCR Cox-2 promoter的模板為Hela細(xì)胞基因組，引物為:同義引物:5'-TAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGAAGGTACCTGGTGTAGTTTTA-3'，反義引物:5'-GAATTCGCTAGCCGCTGCTGAGGAGTTCC-3'。PCR E1的模板為HEK293細(xì)胞基因組，引物為:E1-1同義引物:5'-CCGGAATTCATGAGACATATTATCTGCCAC-3'，E1-1，反義引物:5'-GTATTCCTCCGGTGATAAT-3';E1-2同義引物:5'-ATTATCACCGGAGGAATAC-3'，反義引物:5'-CAGAAAATCCAGCAGGTAC-3';E1-3同義引物:5'-GTACCTGCTGGATTTTCTG-3'，反義引物:5'-ACCCATAGAAGCTTACACC-3';E1-4同義引物:5'-GGTGTAAGCTTCTATGGGT-3'，反義引物:5'-CCGGAATTCGTCGACGCTGCTGCAAAACAG ATA C-3'。

1.2.1.2 重組腺病毒的鑒定 PCR法鑒定:用病毒基因組提取試劑盒提取病毒基因組，PCR腺病毒基因組E2b特異性片段鑒定腺病毒。同義引物:5'-tcgtttctcagcagctgttg-3'，反義引物:5'-catctgaactcaaagcgtgg-3'。PCR E1基因鑒定外源基因，同義引物:5'-ATTATCACCGGAGGAATAC-3'，反義引物:5'-CAGAAAATCCAGCAGGTAC-3'。

Western印跡鑒定E1蛋白表達(dá):SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜，洗膜，顯色，漂洗。(具體操作參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》)。采用的抗腺病毒E1A一抗為本實(shí)驗(yàn)室自制多克隆兔血清。

1.2.2 熒光素酶表達(dá)的檢測(cè) 在6孔板中，將Ade-Cox-2-luciferase 或 Ade-CMV-luciferase 3 μg 用 lipo2000 8 μl轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，設(shè)Ad-Blank(非復(fù)制性5型腺病毒)為陰性對(duì)照，CMV(巨細(xì)胞病毒)為陽(yáng)性對(duì)照，用裂解緩沖液在板中裂解細(xì)胞，晃動(dòng)培養(yǎng)皿數(shù)次以保證裂解緩沖液完全覆蓋細(xì)胞。將細(xì)胞從培養(yǎng)皿刮下，將細(xì)胞及所有的液體轉(zhuǎn)移至離心管中，置于冰上，旋渦震蕩離心管5～10 s，12 000 r/min離心15 s(室溫)。將上清液轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的試管中。將100 μl熒光素酶檢測(cè)試劑加入熒光光度計(jì)試管中，每管一個(gè)樣品。將熒光光度計(jì)的程序設(shè)置為:2 s延遲及10 s熒光素酶活性測(cè)量讀數(shù)。將20 μl細(xì)胞裂解液加入裝有熒光素酶檢測(cè)試劑的熒光光度計(jì)試管中，吹打或輕微旋渦震蕩以混合，上機(jī)檢測(cè)并記錄讀數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 重組腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建 按照腺病毒質(zhì)粒構(gòu)建流程圖構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒Ad-Cox-2-E1，I-Ceu I/PI-SceI雙酶切質(zhì)粒Ad-Cox-2-E1，電泳約4 500 bp及32 000 bp處有點(diǎn)，得陽(yáng)性克隆。見(jiàn)圖1。

2.2 按照腺病毒質(zhì)粒構(gòu)建流程圖構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒 ICeu I/PI-SceI雙酶切質(zhì)粒Ad-Cox-2-luciferase，電泳約4 000 bp及32 000 bp處有點(diǎn)，得陽(yáng)性克隆。I-Ceu I/PI-SceI雙酶切質(zhì)粒Ad-CMV-luciferase，電泳約3 300 bp及32 000 bp處有點(diǎn)，得陽(yáng)性克隆。見(jiàn)圖2。

2.3 重組腺病毒的鑒定 Ad-Cox2-E1在基因水平有特異性E1基因，大小約為3 000 bp，特異性E2b基因，大小為860 bp;在蛋白水平，Ad-Cox2-E1感染細(xì)胞均有特異性E1A蛋白表達(dá)，大小約為45 kD。說(shuō)明在包裝擴(kuò)增純化過(guò)程中，重組腺病毒片段沒(méi)有丟失，外源基因表達(dá)正常。見(jiàn)圖3。

2.4 Ad-CMV-luciferase或Ad-Cox-2-luciferase感染實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，檢測(cè)luciferase表達(dá) 見(jiàn)圖4。

圖1 質(zhì)粒Ad-Cox-2-E1的鑒定

圖2 質(zhì)粒Ad-Cox-2-luciferase和Ad-CMV-luciferase的構(gòu)建

圖3 腺病毒Ad-Cox-2-E1的檢測(cè)

圖4 Luciferase的活性檢測(cè)

近年來(lái)研究表明Cox-2在腦膠質(zhì)瘤、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胃癌等多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移〔1～4〕，并參與腫瘤新生血管的形成，而在大多數(shù)正常組織中不表達(dá)〔5〕。作為一種新的腫瘤特異性啟動(dòng)子，人們對(duì)COX-2啟動(dòng)子進(jìn)行了廣泛的研究，并且其在腦膠質(zhì)瘤、胃腸癌、食道癌〔6，7〕的基因治療研究中表現(xiàn)出很好的治療前景。

條件復(fù)制型腺病毒(conditionally replicating adenovirus，CRAd)是針對(duì)腺病毒本身無(wú)明顯特異性復(fù)制表達(dá)的缺點(diǎn)而構(gòu)建出來(lái)的病毒，它具有的特異性復(fù)制能力及腺病毒本身固有的生物特性，放大了腫瘤治療作用和溶瘤作用〔9〕?，F(xiàn)今，條件復(fù)制型腺病毒越來(lái)越受到人們的重視，并對(duì)其開(kāi)展了廣泛深入的研究。條件復(fù)制型腺病毒與傳統(tǒng)的復(fù)制缺陷腺病毒比較有以下優(yōu)點(diǎn):①病毒可以在腫瘤細(xì)胞內(nèi)大量增殖，直接導(dǎo)致被感染的腫瘤細(xì)胞裂解，裂解擴(kuò)散的病毒可以繼續(xù)感染鄰近腫瘤細(xì)胞;②腺病毒基因表達(dá)的過(guò)程中釋放大量的腫瘤抗原蛋白，傳遞給樹突細(xì)胞和T細(xì)胞識(shí)別，起到了免疫放大效果，加強(qiáng)了腫瘤免疫反應(yīng);③條件復(fù)制型腺病毒自身體積變小，可容量明顯變大，所以可攜帶較大片段的外源性治療基因，即它在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的同時(shí)還通過(guò)攜帶治療基因達(dá)到殺滅腫瘤的效果，這也打下了多途徑多方法聯(lián)合應(yīng)用的基礎(chǔ)。從理論上講，在腫瘤基因治療中，條件復(fù)制性腺病毒及攜帶的抗癌活性基因只要腫瘤細(xì)胞存在，抗癌活性基因就會(huì)繼續(xù)表達(dá)，直至殺死全部的腫瘤細(xì)胞為止。這與因藥物半衰期而療效減退的常規(guī)治療大不相同，所以條件復(fù)制性腺病毒在腫瘤治療中表現(xiàn)出了良好的治療持續(xù)性。

熒光素酶報(bào)告基因〔10〕是把熒光素酶基因的編碼序列和基因表達(dá)調(diào)節(jié)序列融合形成嵌合基因，或與其他目的基因融合，在調(diào)控序列控制下進(jìn)行表達(dá)，通過(guò)熒光素酶生物發(fā)光特性，利用閃爍計(jì)數(shù)器對(duì)熒光素酶的活性作出定量定性檢測(cè)來(lái)標(biāo)定目的基因的表達(dá)狀況。熒光素酶有以下優(yōu)點(diǎn):靈敏度高，特異性好，應(yīng)用范圍廣，無(wú)毒性?；谏鲜鰞?yōu)點(diǎn)，本研究將熒光素酶基因插入Cox-2啟動(dòng)子之后，監(jiān)測(cè)Ad-Cox-2與Ad-CMV在正常細(xì)胞與腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)量。Ad-Cox-2-luciferase感染正常細(xì)胞，luciferase表達(dá)的值為894±100.5，是空白組表達(dá)的1.8倍，說(shuō)明Cox-2啟動(dòng)子在正常細(xì)胞中基本沒(méi)有檢測(cè)到啟動(dòng)活性;Ad-Cox-2-luciferase感染腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞，luciferase表達(dá)的值為10 483±765.6和12 387±1004.2，是相應(yīng)空白組的27倍和30倍，說(shuō)明在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Cox-2啟動(dòng)子具有高啟動(dòng)活性，但是Cox-2啟動(dòng)子在腫瘤細(xì)胞中的啟動(dòng)活性稍低于CMV啟動(dòng)子。以上結(jié)果可以說(shuō)明，在腺病毒載體中Cox-2啟動(dòng)子在正常腦成纖維細(xì)胞中不具有啟動(dòng)活性，即啟動(dòng)特異，其所攜帶的基因只在腫瘤細(xì)胞中特異性表達(dá)，從而達(dá)到比較好的治療作用，同時(shí)降低對(duì)于周圍細(xì)胞的副作用。

本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建并鑒定COX-2啟動(dòng)子攜帶E1A的條件復(fù)制性腺病毒(Ad-COX-2-E1A)，并通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因證實(shí)了Ad-COX-2-E1A在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的啟動(dòng)特異性，可以利用其驅(qū)動(dòng)治療基因特異性表達(dá)，實(shí)現(xiàn)腫瘤的基因治療。

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